骨形成蛋白－2在上颌骨快速牵引骨愈合中的作用＊

姚玉胜，王程越，王桂君

（1.辽宁医学院附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121000；2.辽宁省锦州市中心医院修复科，辽宁锦州121000；3.辽宁医学院药学系，辽宁锦州121000）

作为一种创伤小、出血少的治疗骨缺损及畸形新技术，经骨缝牵引成骨术已引起各科医生的重视［1］。Liu等［2］以兔为实验对象发现，重组人骨形成蛋白－2（recombinant human bone morphogenetic protein－2，rhBMP－2）对骨缝及周围组织的改建有较明显促进作用。范伟等［3］也认为BMP－2单独应用即有较强的诱导成骨活性。为继续探索快速弹性牵引中骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）对扩张骨缝作用，本研究建立了犬腭横缝牵引模型，探讨当牵引力大于800g后加入缓释rhBMP－2对骨质改建的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：选取4～5个月健康杂种犬36只，体质量（3.72±1.35）kg，由辽宁医学院动物中心提供。牵引器：由不锈钢滑道和作用距离为30mm（初始作用力为400、600、800 g）的形状镍钛记忆合金组成，由北京有色金属研究所提供。内水相：rhBMP－2 10mg加入适量盐酸胍溶液溶解后，取100μL与少量牛血清清蛋白混匀形成，由解放军军事医学科学院提供；油相：聚乳酸－羟基乙酸共聚物（poly lactic－co－glycolic acid，PLGA），由山东医疗器械研究所提供；外水相：含1%PVA聚乙烯醇、0.5%吐温－20，由北京化学试剂公司提供。纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS），由杭州普济公司提供；兔抗鼠 BMP－2、BMP－4、BMP－7多克隆抗体，由博士德公司提供；生物素化山羊抗兔IgG，由博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 rhBMP－2缓释胶囊制作 将初乳与10mL外水相经800r／min离心4h，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，形成rhBMP－2／PLGA缓释微球，4～8℃保存。实验时分别将缓释微球与FS的主体胶和粉剂相溶，制成主体胶混悬液和催化剂溶液。二者按1∶1比例通过双管注射器于术后5d注入牵引区附近黏膜下。

1.2.2 实验动物分组及手术操作 将36只健康杂种犬随机分为对照组（n＝4）和实验组（32）只，实验组又分为400g组（n＝8）、600g组（n＝8）、800g组（n＝8）、800g＋rhBMP－2组（联合组）（n＝8）。实验组采用3%戊巴比妥钠（0.1mg／kg）静脉注射麻醉，术前15min阿托品0.01mg／kg肌内注射，先截除尖牙牙冠后行根管治疗。无菌条件下在硬腭中线纵行6cm切口，剥离子翻瓣，找到腭横缝后，电钻钻孔将滑道后板用微型螺钉固定于腭横缝后缘。在腭横缝前测量相应位置后钻孔，分别固定400、600、800g镍钛合金丝及滑杆。镍钛合金固定于腭横缝两侧，通过滑道限制牵引丝扩张方向，可以将两侧骨板按预定轨迹相背移动。牵引5d后通过双管注射器将rhBMP－2／PLGA缓释微球与FS注入联合组动物的牵引区黏膜下。对照组不处理。术后肌内注射青霉素40万μ，共4d。每周拍X线片，以确定上颌骨位移及牵引器固定情况。

1.2.3 标本采集及制作 术后1、2、4、8周以过量麻药处死各实验组动物2只，对照组1只。先行头颅CT横断扫描，扫描区间自外耳道至尖牙区。解剖腭骨剔除软组织后，组织块固定于10%中性甲醛中，5.5%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙3周，脱水、包埋。免疫组织化学染色60℃烤片过夜，一抗采用兔抗鼠BMP－2、BMP－4、BMP－7多克隆抗体，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。按说明书完成免疫组织化学染色，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件进行统计分析，数据以±s表示，各组间比较行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床观察 术中800g组1只犬死亡，给予补充，余均健康，牵引器固定完好。各组术后颅底上牙槽座角（∠SNA）自131°增大至140°±4°（表1）。颅底下牙槽座角（∠SNB）无明显变化，维持在128°左右，各标志点见图1、2。为排除其他影响因素，解剖颅骨标本后按Yao等［4］颅骨各标志点以游标卡尺（E0512）测量（图3），结果显示实验组上颌成功前徙，以600g及联合组明显（表2）。头颅CT扫描显示，各牵引组腭骨水平板均变薄，骨密度显著下降，以800g组（图4）明显，在注射rh－BMP－2后（图5）明显改善，见表3。

2.2 免疫组织化学染色结果 BMP－2（图6）、BMP－4（图7）、BMP－7（图8）阳性染色主要定位于成骨细胞、成纤维细胞及骨细胞细胞质中，细胞以形态学鉴定，其中成骨细胞染色较深。经Image pro plus软件的intensity校正及测量过滤分析，BMP－2、BMP－4 的 累 积 光 密 度 值 （integrated optical density，IOD）值在2周内达到峰值，之后逐渐下降至正常水平。BMP－7则处于低表达状态，但800g在注射rhBMP－2后有所增强，见表4～6。

图1 400g组牵引2周头影测量及各标志点

图2 600g组牵引2周头影测量及各标志点

表1 各组∠SNA、∠SNB测量结果比较（

表2 各组上颌骨前移结果比较（±s，mm）

表2 各组上颌骨前移结果比较（±s，mm）

OI：枕髁中点与中切牙颈部中点距离；OC：枕髁中点与尖牙颈部中点距离；DD：腭横缝两侧固定螺钉间距离；－：此项无数据。

组别 n OI OC DD 4 1.0±0.2 0.8±0.1 － － －400g组 8 16.6±2.8 16.1±2.8 17.8±4.0 0.42 ＜0.05 600g组 8 25.3±5.2 19.5±3.3 22.9±5.2 1.21 ＜0.05 800g组 8 12.1±2.3 12.5±4.9 12.5±2.4 1.46 ＞0.05联合组 8 24.2±3.4 23.8±4.6 23.8±4.2 1.28 ＜t P对照组0.05

表3 CT检测各组腭骨水平板骨密度值比较（±s，HU）

表3 CT检测各组腭骨水平板骨密度值比较（±s，HU）

＊：P＜0.05，与对照组同时间比较。

时间 对照组（n＝4） 400g组（n＝8） 600g组（n＝8） 800g组（n＝8） 联合组（n＝8）第1周 1 235.6±96.0 881.5±81.9 724.7±99.0 294.3±240.7＊892.9±86.6第2周 1 255.7±109.3 929.4±103.3 715.8±84.9 317.8±185.5＊ 1 001.8±95.4第4周 1 260.9±88.3 911.9±71.6 759.6±90.9 349.0±181.0＊ 1 060.7±79.1第8周 1 235.1±100.2 930.9±75.4 839.0±92.0 377.9±160.0＊1 158.0±93.0

图3 牵引器固定位置及各标志点

图4 800g组牵引8周后腭骨水平板密度图像

图5 联合组（8周）腭骨水平板骨密度图像

图6 400g组牵引2周时BMP－2细胞形态（箭头示成骨细胞，×200）

图7 600g组牵引4周时BMP－4细胞形态（箭头示成纤维细胞，×400）

图8 800g组牵引8周时BMP－7细胞形态（箭头示骨细胞，×200）

表4 各组免疫组织化学染色BMP－2IOD值结果（±s）

表4 各组免疫组织化学染色BMP－2IOD值结果（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 n 1周 2周 4周 8周45.0 18 725.0±2 027.0 400g组 8 24 055.0±2 827.0 32 917.0±2 164.0 21 803.0±2 908.0 19 316.0±1 308.0 600g组 8 35 100.0±2 069.0＊ 61 119.0±3 182.0＊ 29 507.0±2 508.0 20 135.0±2 128.0 800g组 8 36 463.0±3 159.0＊ 81 604.0±3 425.0＊ 20 457.0±2 217.0 17 076.0±2 015.0联合组 8 62 337.0±3 274.0＊ 99 038.0±4 825.0＊ 38 546.0±3 275.0＊对照组 4 19 867.0±1 725.0 20 390.0±1 842.0 19 231.0±1 8 32 082.0±2 541.0

表5 各组免疫组织化学染色BMP－4IOD值结果（±s）

表5 各组免疫组织化学染色BMP－4IOD值结果（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 n 1周 2周 4周 8周36.0 18 925.0±2 342.0 400g组 8 24 045.0±2 168.0 31 806.0±2 049.0 21 937.0±3 725.0 20 715.0±2 457.0 600g组 8 35 009.0±3 046.0＊ 61 008.0±2 684.0＊ 30 782.0±2 557.0 21 483.0±2 506.0 800g组 8 38 451.0±3 846.0＊ 81 572.0±2 973.0＊ 20 663.0±1 976.0 17 626.0±1 685.0联合组 8 77 832.0±4 145.0＊ 43 479.0±3 016.0＊对照组 4 17 684.0±1 513.0 18 346.0±2 026.0 17 432.0±1 7 29 845.0±2 160.0 21 974.0±2 827.0

表6 各组免疫组织化学染色BMP－7IOD值结果（±s）

表6 各组免疫组织化学染色BMP－7IOD值结果（±s）

组别 n 1周 2周 4周 8周57.0 24 989.0±2 108.0 400g组 8 11 327.0±2 150.0 15 395.0±1 957.0 21 145.0±2 052.0 26 703.0±1 827.0 600g组 8 12 598.0±1 846.0 18 668.0±2 017.0 21 478.0±2 072.0 28 167.0±1 974.0 800g组 8 13 415.0±1 268.0 17 167.0±2 249.0 15 786.0±1 618.0 24 816.0±1 853.0联合组 8 23 740.0±1 827.0 26 179.0±2 035.0 27 103.0±2 6对照组 4 27 341.0±3 127.0 24 586.0±2 826.0 25 573.0±1 9 39.0 25 704.0±1 893.0

3 讨 论

牵引成骨术已广泛应用于颅颌面畸形治疗，尤其是颌骨畸形较重，正颌手术无法达到预期效果的患者。缺点是存在截骨创伤及较长治疗期，这对患者均有一定心理上影响［5－6］。21世纪初，有研究先后提出采用经骨缝牵引修复颌骨畸形的观点，无需截骨，创伤减小，在临床上也取得了较好的治疗效果［7－9］。本实验根据前期成果［10］，利用镍钛合金形状记忆特性制作“M”形牵引丝，通过滑道后板及滑杆固定于腭横缝两侧，以限制牵引丝扩张方向，使上颌骨按预定轨迹相背移动，自行扩张骨缝。手术植入牵引器仅需10～20min，操作简化。各标志点测量结果显示，颅底∠SNA随牵引逐渐增大，颅底∠SNB没有改变。说明新研制牵引器能有效前移上颌骨复合体，没有扭转颌骨等不良结果。但骨缝牵引仍有牵引成骨缺点即治疗周期长，往往需要6个月甚至1年以上固定期。为缩短治疗期，本研究试用3种不同牵引力，期望找到最佳力值，即可快速扩张骨缝，又不致因力值过大造成对骨缝不可复性损伤。实验中发现牵引力越大，上颌骨前移越明显，但超过800g后上颌骨前期前徙虽然较快，后期明显减慢。CT检测也显示800g组骨密度值降低明显（317.8±185.5）HU，因此，本研究认为，当牵引力大于800g后对生长期犬骨缝有一定损伤，甚至影响其后期生长发育。为达到快速牵引目的，在采用800g牵引力同时加入rhBMP－2，以改善因机械力过大对骨缝及周围组织的负面影响。结果表明，∠SNA并未因采用800g力而减小，上颌骨平均前徙距离也超过600g，平均骨密度值也明显增高。说明rhBMP－2在促进骨形成，修复因过大牵引力对骨缝组织损伤方面起到重要作用。

机械牵引力可以刺激和保持骨组织再生与生长，在这个过程中各种生长因子起到至关重要作用，其中BMP是公认的最重要调节因子之一［11－12］。免疫组织化学染色显示 BMP－2、BMP－4阳性染色主要定位在成骨细胞、成纤维细胞及骨细胞细胞质中，于牵引2周内达到峰值，以800g组增高明显。说明牵引力与BMP－2、BMP－4的活性相关，牵引力越大，活性越强。同时也说明这些细胞的BMP－2、BMP－4受体在整个牵引期处于活跃状态。2周后IOD值则急剧下降，可能是弹性牵引力已大幅下降，如需继续延长骨长度，则需要更换牵引器。BMP－7染色一直处于低表达状态，在注射rhBMP－2后表达明显增强。说明rhBMP－2不仅可单独促进骨质改建，而且有调节BMP－7表达的作用。

骨质改建是一个精确平衡过程，控制或改变任一因素皆有可能导致骨量的增加［13］。针对经骨缝牵引成骨治疗周期长的缺点，本研究选择了力值较大的800g牵引力以加快牵引进程，同时注入促进骨质生成的rhBMP－2，以对抗机械力过大造成骨缝损伤，实验结果理想。

［1］ Liu C，Liu C，Gao Q，et al.Transsutural distraction osteo－genesis versus osteotemy distraction osteogenesis［J］.J Craniofac Surg，2012，23（2）：464－471.

［2］ Liu SS，Opperman LA，Buschang PH.Effects of recombinant human bone morphogenetic protein－2on midsagittal sutural bone formation during expansion［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2009，136（6）：768.e1－8.

［3］ 范伟，张弓，安洪，等.hBMP2和hVEGF165双基因修饰组织工程骨的构建及检测［J］.重庆医学，2010，39（24）：3317－3319.

［4］ Yao Y，Wang G，Wang Z，et al.Synergistic enhancement of new bone formation by recombinant human bone morphogenetic protein－2and osteoprotegerin in trans－sutural distraction osteogenesis：apilot study in dogs［J］.J Oral Maxillofac Surg，2011，69（11）：e446－455.

［5］ 王兴，伊彪，梁成，等.内置式颌骨牵引器的研制及临床研究［J］.中华口腔医学杂志，2002，37（2）：145－147.

［6］ Marchac AC，Arnaud E.Cranium and midface distraction osteogenesis：current practices.Controversies，and future applications［J］.J Craniofac Surg，2012，23（1）：235－238.

［7］ Mccarthy JG.Sutural expansion osteogenesis for management of the Bony－Tissue defect in cleft palate repair：experimental studies in Dogs［J］.Plast Reconstr Surg，2000，105（6）：2026－2027.

［8］ Graewe FR，Morkel JA，Hartzenberg HB，et al.Midface distraction without osteotomies in an infant with upper respiratory obstruction［J］.J Craniofac Surg，2008，19（6）：1603－1607.

［9］ Park DH，Yoon SH.The trans－sutural distraction osteogenesis for 22cases of craniosynostosis：a new，easy，safe，and efficient method in craniosynostosis surgery［J］.Pediatr Neurosurg，2011，47（3）：167－175.

［10］姚玉胜，柳春明，常世民，等.生长期犬上颌骨缝牵张的实验研究［J］.口腔颌面修复学杂志，2008，34（2）：81－84.

［11］Yang JH，Kim HJ，Kim SE，et al.The effect of bone morphogenic protein－2－coated tri－calcium phosphate／hydroxyapatite on new bone formation in a rat model of femoral distraction osteogenesis［J］.Cytotherapy，2012，14（3）：315－326.

［12］刘道华，夏德林.细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展［J］.重庆医学，2010，39（2）：244－246.

［13］Fang TD，Salim A，Xia W，et al.Angiogenesis is required for successful bone induction during distraction osteogenesis［J］.J Bone Miner Res，2005，20（7）：1114－1124.