miRNA－142－5p在特应性皮炎中的表达及其靶基因预测＊

肖能鑫，史丙俊，刁庆春，王修勇，蒋有让，闫国富

（重庆市第一人民医院皮肤病与性病科，重庆400011）

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病。多自婴儿期起病，病情迁延反复。其病因及发病机制还未完全清楚，目前考虑为一种多基因病，涉及环境、基因及免疫之间的相互作用。近年来，一类新型微RNAs（microRNAs，miRNAs）分子在医学学科的研究中备受关注，其为一类长度大约为20～25个核苷酸小分子RNA，分布广泛。据推测，miRNAs可负反馈调节人类约1／3基因编码的mRNA［1］。miRNA可通过两种机制致使特定基因的沉默，对机体生长、发育及各种疾病尤其是肿瘤的发生和发展具有重要的调节功能。研究miRNA以及其生物学功能，特别研究其对肿瘤的负反馈调节的作用，是生命医学研究的最新方向之一。近年来，运用基因芯片与高通量测序技术，已筛选出多种与疾病相关miRNA，证实了miRNA与人类重大疾病（如肿瘤、神经系统疾病、免疫性疾病等）的发生、发展存在相关性［2］。目前尚少有相关的文献资料关于AD患者外周血单个核细胞（PBMC）中miRNA的研究。本研究初步探索AD患者PBMC中miRNA的变化，并进行生物信息学分析预测其靶基因，旨在为研究AD的分子调控机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年10月至2012年2月本院皮肤科门诊AD患者8例（观察组），其中男2例，女6例；年龄3～16岁，平均（8.0±3.8）岁。入选标准：（1）符合 Hanifin ＆ Rajka AD诊断标准；（2）3～16岁患者；（3）病程1年以上，每年缓解期小于3个月者。排除标准：血液常规及肝、肾功能检查有严重异常的患者；患有传染病、精神疾病、血液疾病、肿瘤、结缔组织病、糖尿病、心脏病等系统疾病者；近1个月内系统使用糖皮质激素药物或免疫抑制剂者。选择同期年龄、性别与观察组相匹配的健康体检儿童6例为对照组。

1.2 方法

1.2.1 主要实验试剂 miRcute miRNA提取分离试剂盒（离心柱型）、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒、miRNA－142－5P和has－U6检测引物均购天根生化科技有限公司。

1.2.2 PBMC分离及miRNA的提取分离 Ficoll密度梯度离心法分离PBMC；miRNA的提取分离，按试剂盒操作说明书提取分离miRNA，而后进行纯度和浓度的检测。

1.2.3 逆转录合成miRNA cDNA第一链 首先进行miRNA 3′末端加尾处理，所得的Poly（A）反应液，取2μL配制cDNA反应体系进行下一步cDNA第一链合成，所得的cDNA第一链置－20℃保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR（real－time PCR） 采用SYBR GreenI嵌合法，以U6为内参照进行实时荧光定量。本实验采用逆转录产物10倍稀释法建立标准曲线［3］，每种浓度设2个平行复孔。按照上述real－time PCR条件，对前期制备的各样本的逆转录产物进行miRNA－142－5p检测。每个miRNA做1次PCR，每个样本均做3个平行复孔，取其平均值分析。

1.2.5 数据处理 首先计算所有标本miRNA－142－5p和U6的3个重复孔的平均CT值，将其作为每个样本的实际CT值，将同一样本miRNA－142－5p CT值减去其相应U6的CT值，获得△CT值，在所有PBMC样本的△CT值中选择最大值△CT（max）作为衡量的标准，用其它样本的△CT值减去△CT（max），得到每一个样本的△△CT值，最后求得每一个样本的相对表达量2－△△CT。

1.2.6 miRNA－142－5p靶基因预测 应用 miRanda、miRDB、PicTar、miRWalk、RNA22、Targetscan数据库预测，选取至少5种计算方法均能预测到的基因作为其潜在靶基因。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析，所有数据均进行正态性检验。正态分布的计量资料以±s表示，相对表达量比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA－142－5p real－time PCR扩增曲线及融解曲线 采用SYBR Green I嵌合法检测 miRNA－142－5p的表达，在所有的样本中均能得到良好的扩增。miRNA－142－5p和内参U6扩增效率基本一致（S值差绝对值小于0.1），可以用2－△△CT计算相对表达量。各样本融解曲线呈单峰，说明扩增无二聚体形成，扩增产物单一，见图1、2。

图1 miRNA－142－5p扩增曲线

2.2 两组PBMCs中miRNA－142－5p表达水平比较 miRNA－142－5p在观察组患者PBMC中的相对表达量为（72.16±20.94），在对照组PBMC中的相对表达量为（18.79±13.19），AD患者的PBMCs中 miRNA－142－5p表达均上调，其表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P＝0.02）。

2.3 miRNA－142－5p靶基因预测 5或6个数据库同时预测出靶基因数目为39个，其中包括：MAGI2、MARCH6、IGF2BP3、DCBLD2、CPEB2、ADPRH、ZNF569、SH3D19、HIPK1、CENTB2、SGMS1、SACS、HNRPH3、LRP2、MYCN、OTX2、PCDH9、PCTK2、LRP1B、ATG16L1、BTBD7、CXCR7等。结合GenBank数据库得到相关靶基因的信息，它们参与细胞周期、信号转导、细胞凋亡、细胞分化等各个方面的调控。

图2 miRNA－142－5p融解曲线

3 讨 论

miRNA己成为细胞生物学、基因遗传学以及临床学科等领域的研究热点。其通过mRNA的降解或序列特异性抑制来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化与凋亡等一系列的重要生物学进程［4］。miRNA参与正常免疫系统发育的调控［5］和慢性炎症性疾病的发病过程［6］，机体细胞在接收到内源性或外源性信号后，miRNA可出现相应表达，其作为机体对内外环境变化后一种早期反应，参与了固有免疫应答过程。

miRNA－142位于人类17号染色体上，有2个亚单位：miRNA－142－3p和 miRNA－142－5p。成熟 miRNA－142－5p单链序列为：5′－CAUAAAGUAGAAAGCACUAC－3′。miRNA－142在造血干细胞的分化中具重要作用。miRNA－142－5p在T细胞中有明显的表达，Wu等［7］用基因芯片技术检测了初始T细胞、效应性T细胞和记忆性T细胞中miRNAs的表达，发现并证实了miRNA－142－5p等在效应性T细胞中表达下调，而在初始T细胞和记忆性T细胞中表达上调。Landgraf等［8］研究亦表明，miRNA－142在外周血CD8＋T细胞中表达上升。Annoni等［9］研究发现，miRNA－142可能通过调控抗原在抗原提呈细胞中的表达，诱导抗原特异性调节性T细胞的产生，从而使机体产生免疫耐受。Nakamachi等［10］研究发现，相对于骨性关节炎患者，miRNA－142在类风湿性关节炎患者的胶原纤维中表达上调。2010年，Sonkoly等［6］研究了AD患者皮损中miRNA的表达，发现与健康对照组相比，AD患者皮损中共有44个miRNA差异性表达，其中10个miRNA上调表达，包括miRNA－142－5p，miRNA－142－3p。本研究表明，与健康人相比，miRNA－142－5p在 AD患者PBMC中表达上调，与Sonkoly等［6］关于miRNA－142－5p在AD患者皮损的研究结果相一致。

目前关于miRNA－142－5p的相关报道较少，其在AD的发病过程的作用还不清楚。本研究通过生物信息学技术查找到miRNA－142－5p可与多个基因3′UTR相结合，下一步需要对其可能的靶基因进行实验验证，从而为AD的靶基因治疗等提供新的依据。

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［2］ Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood－based markers for Cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（30）：10513－10518.

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［5］ Sonkoly E，Stahle M，Pivarcsi A.MicroRNAs and immunity：novel players in the regulation of normal immune function and inflammation［J］.Semin Cancer Biol，2008，18（2）：131－140.

［6］ Sonkoly E，Janson P，Majuri ML，et al.MiR－155is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T－cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte－associated antigen 4［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，126（3）：581－589.

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［8］ Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression Atlas based on small RNA library sequencing［J］.Cell，2007，129（7）：1401－1414.

［9］ Annoni A，Brown BD，Cantore A，et al.In vivo delivery of a microRNA－regulated transgene induces antigen－specific regulatory T cells and promotes immunologic tolerance［J］.Cell，2009，114（25）：5152－5161.

［10］Nakamachi Y，Kawano S，Takenokuchi M，et al.MicroRNA－124ais a key regulator of proliferation and monocyte chemoattractant protein 1secretion in fibroblast－like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2009，60（5）：1294－1304.