黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒所致病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织连接蛋白43mRNA表达的影响

于影，马奎影，侯春霞，柳文清，赵明

（内蒙古民族大学附属医院心内科，通辽 028000）

心律失常是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）主要的临床表现之一，尤其是各种室性心律失常。缝隙连接是相邻细胞间的跨膜通道，允许小分子物质如离子及第二信使通过，成为相邻细胞间物质交换及信号传导最直接的方式。连接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室缝隙连接的主要构成成分，其分布及功能的改变对于缝隙连接的活性有重要影响［1，2］。研 究［3－5］发现，急性 VMC 小 鼠 心 肌 组织中Cx43表达明显减少。黄芪总黄酮（totalflavonoids of astragalus，TFA）是从豆科类植物黄芪中分离出来的有效活性成分［6］，研究［7］发现TFA可显著降低VMC小鼠心律失常发生率，但TFA对Cx43mRNA作用还未见报道。故本实验通过观察TFA对实验性小鼠柯萨奇B3病毒（coxsackie virus B3，CVB3）所致 VMC 心肌 Cx43 mRNA的影响，来探讨它的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1）实验动物：新生BALB/c小鼠，二级动物，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。2）TFA由内蒙古民族大学有机化学实验室提供，分别按10 mg·L－1、20mg·L－1和40mg·L－1加蒸馏水制备成不同浓度溶液备用。3）病毒：CVB3和 Woodruf亲心肌株。

1.2 CVB3及实验性小鼠CVB3所致VMC模型制备

1.2.1 病毒扩增 按CVB3标准培养方法，经HeLa细胞传代生长3代，收集所有细胞悬液，3 000 r/min离心10min，取上清液测病毒浓度为108 PFU/mL（空斑形成单位），分装后，-30℃保存，以备接种BALB/c小鼠。

1.2.2 实验性小鼠CVB3所致VMC模型 病毒感染组与TFA组腹腔内无菌注射含0.1mL 50倍半数组织细胞感染量（50TCID50）CVB3，正常对照组不注射CVB3。

1.3 实验分组及实验数据的采集和处理

将4周龄体质量为13～15g雄性BALB/c小鼠125只随机分为5组（n＝25），分别为正常对照组，病毒感染组，TFA高、中、低剂量组，根据已发表文献及本项目前期实验，经过人鼠折算，TFA低剂量组设定为TFA 10mg·L－1，中剂量组设定为TFA 20mg·L－1，高剂量组设定为 TFA 40mg·L－1。TFA低剂量组每日 TFA（10mg·L－1）灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14d；TFA 中剂量组每日TFA（20mg·L－1）灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14 d；TFA高剂量组每日 TFA（40mg·L－1）灌胃，0.2 mL/次，2次/d，共14d；病毒感染组及正常对照组每日生理盐水灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14d。

1.4 一般状况观察

观察动物的精神状况、饮食、活动、大小便、皮毛色泽形态及死亡数等。

1.5 病理取材及切片制作

病毒感染及给药后第14天，各组分别随机取15只或剩余小鼠，脱颈椎处死后，立即沿腹中线剪开。在无菌状态下将小鼠左肋剪开，暴露心脏，用眼科剪子将心脏取出。将上1/3心脏组织放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片。无菌取出心肌切片，脱蜡、二甲苯透明，进行HE常规染色及免疫组织化学染色，于光镜下观察病理变化。

1.6 使用real-time PCR技术比较各组心肌组织Cx43mRNA的水平

取50mg小鼠心肌组织Trizol法（Invitrogen公司）提取心肌总RNA，紫外分光光度计测吸光度值，计算RNA浓度，琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。采用逆转录试剂盒（北京博奥森公司）进行逆转录。PCR反应具体引物序列如下：上游引物：GTTCCACCACTTTGGCGTGC， 下 游 引 物：CAGGTGTAGACCGCACTCAG（上下游引物从左至右是5＇——3＇）。将含有目的扩增片段的质粒DNA稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/UL，使用实时PCR仪测定定量曲线和标准曲线。比较正常心肌细胞、病毒感染心肌细胞和TFA各剂量组心肌细胞Cx43mRNA的水平，观察TFA对病毒感染心肌细胞Cx43mRNA的作用。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，两组间均数比较采用t检验，变量间的相关分析采用直线相关分析，数据用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况

正常对照组小鼠活动自如，无1例死亡。TFA各治疗组小鼠的一般情况好于病毒感染组。病毒感染组小鼠在接种0.1mL 50倍半数组织细胞感染量（50TCID50）CVB3后第3天，出现明显的活动减少，精神不佳，毛蜷缩无光泽，对刺激反应迟钝，进食、进水量减少，第5天出现死亡，死亡高峰在第7～9天。TFA各组小鼠死亡时间推迟到第10天开始死亡。

2.2 病理学改变

2.2.1 心脏大体改变 正常对照组小鼠心脏外观无明显改变。病毒感染组病变最严重，每只小鼠心外膜均可见大面积的黄白色斑点，心外膜下淤血。各治疗组情况均好于病毒感染组，其中TFA高剂量组小鼠心外膜偶见黄白色斑点，心外膜下无淤血。2.2.2 光镜观察 小鼠部分心脏用10%的甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，光镜下观察小鼠心肌的病理变化。HE染色结果：正常对照组小鼠心肌纤维排列整齐，结构清晰，细胞质丰富均匀，嗜酸性，被伊红染成淡粉红色，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，嗜碱性，被苏木精染成蓝色，核仁清晰，未见心肌纤维变性坏死等病理性改变。CVB3感染后各组均出现了不同程度的病理学改变，病毒感染组病理改变明显，可见心肌纤维排列紊乱，部分心肌细胞质被伊红染成深粉红色，细胞核固缩变性，核仁消失，心肌纤维间隔明显增宽，间质明显水肿，可见少量淋巴细胞浸润。TFA高剂量组小鼠心脏出现轻微改变，心肌纤维排列尚可，结构清晰，细胞质丰富均匀被伊红染成淡粉红色，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央被苏木精染成蓝色，核仁清晰，偶见心肌细胞质被伊红染成深粉红色，细胞核固缩变性，核仁消失，心肌纤维间隔略增宽，间质轻度水肿，偶见淋巴细胞浸润（见图1）。

图1 A：病毒感染组心肌纤维排列紊乱，可见淋巴细胞浸润（HE×200）；B：TFA高剂量组心肌纤维排列尚可，结构清晰，偶见淋巴细胞浸润（HE×200）

2.2.3 各组心室肌组织Cx43mRNA的水平比较

与正常对照组相比，病毒感染组Cx43mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与病毒感染组相比较，TFA各组Cx43mRNA表达均增多，尤其是TFA高剂量Cx43mRNA表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）（见图2）。

图2 TFA对VMC小鼠心肌组织Cx43 mRNA表达的影响

3 讨论

近年来，研究发现恶性室性心律失常发生机制与心肌电重构密切相关，而心肌电重构不仅包括细胞膜离子通道的变化，也包括细胞间缝隙连接的改变，甚至在某些情况下后者显得更为重要。Cx43作为心肌细胞缝隙连接的主要连接蛋白，对心肌电生理重构的影响至关重要。研究［8］表明，细胞间电偶联障碍是心律失常发生的重要原因。VMC发病过程中有多种细胞因子产生和分泌，它们形成了一个细胞因子网络参与的免疫和炎症反应，可直接或间接损伤心肌的结构和功能［4］。蔡少华等［5］研究发现Cx43在正常小鼠心肌闰盘中分布均匀，VMC时Cx43的分布面积和密度明显减弱甚至阴性，VMC小鼠较正常小鼠出现较明显的心律失常。总之，VMC时Cx43表达明显减少，连接蛋白合成减少是VMC并发心律失常的重要原因。

TFA是从蒙古黄芪中分离的抗氧化清除自由基的主要活性成分，TFA中主要含有6种单体化合物，分别是β－谷甾醇、芒柄花素、毛蕊异黄酮、β－谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷［6］，其中4种为异黄酮类化合物。系列研究［7，8］表明，TFA对VMC并发心律失常具有保护性作用，可减少心律失常发生，但TFA对VMC并发心律失常发挥作用的机制尚未完全阐明。本研究观察到VMC心肌炎小鼠急性期心肌组织Cx43mRNA表达下降，TFA能明显提高CVB3所致VMC小鼠急性期心肌组织Cx43mRNA表达，这一结果有助于阐明TFA减少VMC并发心律失常的作用机制。

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