种公猪PCV－2感染与繁殖障碍

孙 燕，梁望旺，谢建华，周 琼，曾 政，熊仲良，米自由＊

（1.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆渝北401120；2.重庆璧山县动物卫生监督所，重庆璧山402760））

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是1974年Tischer等在猪肾细胞系（porcine kidney cell line，PK－15）中发现的一种单链环状DNA病毒，该病毒以滚环方式复制，呈20面体对称，无囊膜，直径为17nm。PCV有2种基因型（PCV－1和PCV－2），二者的核苷酸同源性为68%。PCV－1无致病性，而PCV－2是引起仔猪多种疾病的病原之一，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post－weaning multisystemic syndrome，PMWS）、猪皮炎－肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）等，现统称圆环病毒相关疾病（PCV－associated disease，PCVAD）。病原学及血清学调查表明，PCV－2在许多国家都广泛存在，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。

PCV－2感染一般发生于母源抗体消失后的断奶仔猪（7周龄～15周龄），引起临床或亚临床疾病。垂直传播是引起繁育母猪和仔猪感染的重要途径。本文就感染PCV－2公猪的症状及检测、人工授精精液的病毒污染情况，精液传播的检测等几方面进行了综述。

1 PCV－2感染公猪的临床症状和眼观病变

通常，性成熟的公猪感染PCV－2普遍缺乏相关的临床症状与眼观病变［1］，在自然或试验条件下感染PCV－2的公猪其精液形态、活力及精液品质也不会受影响［2］。但是，Opriessnig T 等［3］报道了11月龄PCV－2感染阳性猪混合感染了肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的临床病例。

2 PCV－2感染公猪的检测

对流产或产弱仔的母猪生殖器官或其拭子及弱仔猪的血清进行PCV－2、PRRSV、PPV、衣原体和钩端螺旋体等的PCR检测发现，虽然60%～70%的繁殖障碍发生于继发感染，而PCV－2检出率可达14.7%，大多数为混合感染［4－5］。通过对 PCV－2血清阳性的母猪人工授精输入PCV－2b感染的精液，结果发现，宫内暴露仍可使母猪发生感染，同时由于母体抗体滴度的降低也增加了胎儿感染的几率［6］。

2.1 精液的病毒检测

在接种PCV－2后2d～5d的急性感染期，能从血清和精液中检测到PCV－2DNA。Larochelle R等［7］观察记录4头PCV－2阴性的猪通过鼻内接种病毒后精液含病毒的情况，47d的观察期内可间歇性检测到病毒DNA。Grasland B等［8］对4头接种病毒的公猪精液样本连续监测了8周，也得到相同结论。Madson D M等对12头长白猪滴鼻和肌肉注射接种病毒，连续监测90d，发现精液可持续带毒。自然感染的公猪一直到27.3周精液中仍零星检测到PCV－2DNA，病毒DNA含量在接种后9d～20d达到最高，为105.1基因拷贝／mL～106.0基因拷贝／mL。

2.2 血液的病毒检测

试验接种的公猪至少持续90d表现为病毒血症，且最后一次检测到无细胞病毒血症后至少47d仍能从血液中检测出病毒DNA［1］。这种现象被认为是由于外周血中单核细胞中还有结合病毒。通常病毒血症的检出时间早于精液，但也有报道无病毒血症者也可能在精液中含有病毒［7］。通常接种2周后可产生PCV－2抗体。有研究发现，血清或血液的PCV－2PCR检测结果与精液的PCR结果并不完全一致［9］，因而不能以血清或血液样本检出PCV－2的DNA来说明精液中也含有PCV－2的DNA。但在急性感染期，二者具有相关性，血清样品PCR检测结果对精液中是否有具PCV－2有可预测性［1］。

2.3 性腺组织的病毒检测

感染PCV－2的公猪性腺和副性腺含有病毒DNA或抗原。在无临床症状的公猪的尿道球腺、睾丸、附睾、前列腺和精囊，通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和原位杂交技术（insituhybridization，ISH）均 能 检 测 到 PCV－2 抗 原 和DNA［3，10］。采用IHC从自然感染公猪的精囊间质性巨噬细胞和成纤维细胞样细胞内检测到丰富的PCV－2抗原［3］。从受感染公猪的尿道球腺，附睾组织比其他副性腺检测到PCV的几率更大［2］。实时定量PCR检测到试验感染公猪的睾丸、尿道球腺、附睾、前列腺和精囊含有PCV－2DNA，阳性检测量基本相同［1］。从自然感染的公猪阴茎中也检测到病毒 DNA［10］。

3 人工授精与PCV－2传播

3.1 人工授精与猪的繁育

人工授精（artificial insemination，AI）是世界上绝大多数大型种猪繁育系统采取的标准做法。20世纪90年代初，北美近60%的猪群均采用AI技术进行繁育，西欧国家猪群AI的比率高达90%以上。虽然AI在养猪生产中能大大加速遗传改良进程，但从外部（AI中心）引进公猪精液时也可能有疾病传播，从公猪精液中可检测到多种病毒，其中就包括PCV－2［11］。

3.2 人工授精与PCV－2的传播

有研究者对精液作为PCV－2传播源的风险进行了调查和评估。对安大略省的25个PCV－2血清学阳性猪场的调查发现，无论使用购买精液或自然交配，都没有发现精液与生长猪PMWS的发病率之间的关联。对瑞典和新西兰PMWS发病猪群的流行病调查也发现，PCV－2不通过精液传播，疾病的空间分布与公猪精液无关。

为更全面的分析公猪精液是否引发PMWS，研究人员对法国149个猪场进行了调查，它们都从同一个供精站购买精液，其中59个发生PMWS的自繁自养猪场，有55个猪场从来没有发生PMWS，35个猪场以前发生过PMWS已恢复正常，表明购买公猪精液和发生PMWS没有相关性。但是，生长猪发生PMWS的风险与农场精液是否带毒呈正相关［12］。

3.3 精液中病毒DNA检出情况

公猪精液中是否能检测到PCV－2DNA主要取决于年龄和品种［13］。表1总结了不同国家患病PCV－2的精液散播。除年龄和品种之外，如果不进行预防接种，那么任何时候抽检一个精液站，其中约20%的公猪个体的精液带毒。

表1 PCV－2的精液散播Table 1 Transmission of PCV－2in boar semen

4 人工授精中的PCV－2传播

4.1 病毒分离

公猪精液中可能含有多种细菌和病毒，并传染到繁育母猪。很难采用细胞培养的方式来对PCV－2感染精液进行评估，因为不仅精液对细胞系有毒性，而且PCV－2是非致细胞病变的病毒。然而，Kim J等［14］报道曾成功地从原始精液样本分离到PCV－2。

4.2 生物测定

Madson D M 等［15］采用腹腔注射 PCV－2a或PCV－2b建立的急性感染3周龄的公猪模型，用于观测对精液的感染，将携带PCV－2a或PCV－2b的精液输精给PCV－2阴性的母猪，结果PCV－2不能传给后备母猪或后代，使用自然感染PCV－2的公猪精液进行AI也不能感染繁育母猪。但在精液稀释液中加入5mL病毒细胞培养原液（104.2TCID50／mL），则可使阴性母猪发生繁殖障碍［16］，也可能造成血清学阳性母猪子宫内胎儿感染［17］。血清学阳性的母猪表现出病毒血症的持续时间短（1周～2周），也没有明显的临床症状，娩出非活产仔猪没有增多，但仔猪表现PCV－2病毒血症。上述研究表明PCV－2通过AI的传染性具有剂量依赖性，通过精液也可能造成PCV－2的传播。

虽然精液稀释后病毒浓度降低，通过精液传播的风险减小，但由于种公猪群PCV－2阳性率高而增加了AI传播的风险，可能导致原来自然交配的繁育场或PCV－2阴性的动物也发生感染。因此，在动物育种方案中建议对原来为阴性的动物场群以及供精的公猪群精液加以检测，以降低通过精液传播的潜在风险。

4.3 精液中PCV－2的检测

除了病毒分离技术，更敏感的PCR方法通常用来检测精液中是否含有病毒DNA。套式PCR［14，18］和实时定量PCR［19］已被证明能用于检测自然暴露和试验感染公猪的精液中PCV－2DNA。有研究报道将60份原始精液离心分离成精浆、非精子细胞成分和精子组份，结果28份精液（46.7%）中检测到病毒DNA，所有28份精液中精浆都呈阳性，11份非精子细胞成分和4份精子组分中含有病毒DNA［19］。研究人员还用套式PCR检测了98份精液的PCV－1，PCV－2和PPV，其中26份（26.53%）含有病毒DNA，再对26份阳性精液进行组分分离检测，结果26份精浆、9份非精子细胞成分和3份精子组份为病毒DNA阳性［14］。

用实时定量PCR发现精液细胞组分中较精浆组分中含有更多的病毒DNA［19］。从原始精液中的所有组分中均可检测出病毒DNA，套式PCR检测表明精浆中可能含有更大量的DNA。以精液作为检测样本，实时定量PCR不仅可以筛查精液是否含有病毒，也可以诊断公猪精液是否传播病毒。

5 对种猪PCV－2相关疾病的控制

在无可用的商业PCV－2疫苗之前，主要通过管理措施，包括减少应激、减少混合感染等来预防猪群PCVAD等相关疾病。近年来已有商业性灭活疫苗，但有关PCV－2疫苗对公猪保护的有效性的评估研究较少。

Erlandson K R等［20］报道，接种疫苗的种公猪比不接种的公猪的ELISA检测抗体阳性率高，但在84d的试验期内发现接种对公猪是否表现病毒血症无影响，公猪在进入精液采集站后的30d，接种疫苗的并未降低精液带毒率。另有报道［21］对16头5月龄的长白公猪中的8头接种了PCV－2疫苗，35d后对所有公猪进行PCV－2感染。结果接种了疫苗的公猪检测到病毒血症，从病毒接种后4、7、14、21d的精液中检测到病毒DNA。病毒感染后的4d，接种疫苗后的公猪精液中含有较少的病毒DNA，而未接种疫苗的病毒含量较高。通过建立PCV－2和猪肺炎支原体混合感染试验模型评估了PCV－2疫苗接种公猪的效果研究表明，分别在混合感染模型建立前的35d和21d对PCV－2阴性的成年公猪接种疫苗，收集混合感染后5周内的精液和血清样品，检测其PCV－2DNA。结果发现，混合感染又没有接种疫苗的公猪精液中病毒DNA含量远高于单一感染和疫苗接种的公猪［22］。

Blomqvist G等［23］尝试采用对精液进行梯度离心和浮游的方法对精液中的病毒进行清除，结果发现能去除99%的病毒，且对精液质量没有明显影响。

由于相关文献和信息有限，难以对疫苗接种公猪的时间、剂量、接种次数、疫苗类型以及免疫效果提出有效建议，但试验研究已经表明接种疫苗有助于降低精液的带毒比率。由于精液采集站和母猪繁育场同样具有PCV－2传播风险，因此，推荐在进入精液采集场之前接种疫苗或加强公猪的免疫反应性。

6 问题与展望

虽然在PCV－2引起繁殖障碍的研究中，PCV－2可能通过公猪传播被大量文献支撑，但有关PCV－2感染和垂直传播的确切发病机制仍知之甚少。Nauwynck H J等［24］对PCV－2的嗜细胞性和进入细胞的过程进行了研究，华利忠等［25］认为PCV－2感染通过胞内Ca2＋超载诱导细胞凋亡。刘羽茜［26］的研究发现，猪源钙结合蛋白S100A12能持续稳定地促进 PCV－2在 PK－15细胞中的复制，推 测S100A12可能在PCV－2感染和增殖过程中起着重要作用。李建东等［27］用PCV－2感染40日龄健康长白仔猪后定期对皮肤源DC内源性抗原加工递呈相关分子（LMP7、UBP、MHC－I、calreticulin）mRNA水平的变化进行定量分析，结果表明，PCV－2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。

要切实阻断精液传播的路径，提出切实可行的种公猪免疫方案，包括疫苗接种的时间、剂量及接种次数等做出具体有效的建议，除了对疫苗的研制进行优化外，还需对PCV－2传播入种猪群在精液中的最小剂量、抑或是输入到母畜子宫内的引起感染的最小剂量、母体抗体水平与病毒剂量、病毒进入子宫内感染母畜的作用机制等方面进行深入研究。

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