奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定、血清型及耐药性研究

王 凤，宋 立，汤德元＊，张纯萍，徐士新，魏蕊蕊

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.中国兽医药品监察所，北京100081；3.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

奶牛乳房炎 （Bovine mastitis）是当今世界各国奶牛生产中造成经济损失最多的一种疾病，成为严重制约奶产业发展的主要原因之一，是科研、生产领域都很关心的问题［1］。奶牛乳房炎不仅影响产奶量，而且影响乳的品质，甚至危及人的健康［2］。因此，及时、准确地掌握病区奶牛乳房炎病原菌的种类、流行血清型和耐药性情况是治疗该地区奶牛乳房炎的关键。本项研究对北京、河南、天津及广西等地区奶牛乳房炎病原菌的流行情况进行调查，分析这些地区奶牛乳房炎的主要致病菌，并对分离到的致病菌进行了血清型鉴定及耐药性研究，为这些地区奶牛乳房炎的有效防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 大肠埃希菌23株，金黄色葡萄球菌16株，链球菌38株，从北京、河南、天津及广西等地区临床型乳房炎的82份新鲜牛奶分离获得。大肠埃希菌标准株ATCC25922，金黄色葡萄球菌标准株ATCC26085，链球菌标准株ATCC 49619购于北京天坛中国药品生物制品检定所。

1.1.2 试剂 普通营养琼脂、血琼脂、麦康凯琼脂，由中国兽医药品监察所基础保障室提供。金黄色葡萄球菌显色培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；API试条为梅里埃生物公司产品；MIC药敏板，参考美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的方法［3］，将抗菌药稀释成不同测试浓度包被在96孔板里，委托天津市金章科技有限公司冻干制成；金黄色葡萄球菌血浆凝固酶分型血清为日本生研株式会社产品；大肠埃希菌菌体抗原分型血清为丹麦国家血清研究院产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌常规鉴定 大肠埃希菌：麦康凯琼脂筛选，纯化，API20E试条鉴定，再进行O抗原血清型鉴定；金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌显色培养基筛选，纯化，API Staph试条鉴定，再进行血浆凝固酶血清型鉴定；链球菌：绵羊鲜血琼脂培养基 筛选，API 20Strep试条鉴定、CAMP试验鉴定。

1.2.2 分子生物学鉴定 参考文献［4］，根据大肠埃希菌phoA和金黄色葡萄球菌nuc基因；无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌16SrDNA基因，分别合成上下游引物（表1）。提取细菌基因组DNA，按常规PCR方法进行检测。

表1 基因扩增引物Table 1 Primers of gene amplification

1.2.3 药敏试验及耐药率 菌液接种于MIC药敏板，35℃恒温培养箱中培养16h～18h，参考美国CLSI折点判读结果，ATCC25922，ATCC26085，ATCC49619质控菌株结果在质控范围，则试验成立。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

从82份乳样本中分离鉴定出细菌110株，其中大肠埃希菌23株，占分离菌的20.9%；金黄色葡萄球菌16株，占14.5%；链球菌38株（无乳链球菌（B群）16株、停乳链球菌10株、乳房链球菌12株），占34.5%；真菌1株，占0.9%；其余是弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟杆菌等。分离的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和链球菌总数占分离菌株比例的70.0%。经PCR扩增后，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌分别扩增出622、484、162、264、451bp左右的基因片段，与目的片段大小一致（图1～图5）。

图1 大肠埃希菌phoA基因PCR鉴定Fig.1 PCR identification of phoA gene of Escherichia coli

2.2 药敏试验结果

23株大肠埃希菌对利福平耐药率最强，达100%，对氨苄西林等次之，耐药率均低于17.40%，对其他5种药物敏感；16株金黄色葡萄球菌除对青霉素和氨苄西林的耐药率最强，达81.20%以上，对红霉素等次之，耐药率均低于31.30%，对万古霉素等8种药物敏感；38株链球菌对链霉素等耐药率最强，达52.60%以上，对恩诺沙星等10种药物次之，耐药率均低于39.50%，对万古霉素敏感。总之，此次分离的病原菌除对部分药物100%敏感外，对其他药物均表现出不同程度的耐药（表2）。

图2 金黄色葡萄球菌nuc基因PCR鉴定Fig.2 PCR identification of nuc gene of S.aureus

图3 无乳链球菌16SRDNA基因PCR鉴定Fig.3 PCR identification of 16SrDNA of S.agalactiae

图4 停乳链球菌16SRDNA基因PCR鉴定Fig.4 PCR identification of 16SrDNA of S.dysgalactiae

图5 乳房链球菌16SrDNA基因PCR鉴定Fig.5 PCR identification of 16SrDNA of of S.uberis

表2 77株奶牛乳房炎病原菌耐药试验结果Table 2 The drug resistance results of 77strains of pathogenic bacteria of dairy cow mastitis

2.3 大肠埃希菌血清型鉴定结果

23株大肠埃希菌中有16株能定型，分属9种血清型，优势血清型为O13、O17和O91，这3种血清型的菌株占已鉴定菌株的58.82%，少数菌株有2种以上血清型。北京地区的血清型有O126、O148；广西地区的血清型有 O13、O17、O18ab、O68、O91、O93。另有7株菌株未能定型，占分离菌株的30.43%（7／23）（表3）。

2.4 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶血清型鉴定

根据凝固酶血清型判定标准，得到16株金黄色葡萄球菌的凝固酶分型结果，Ⅴ 型（6.25%）、Ⅵ 型（43.75%）、Ⅶ 型（18.75%）、复合型（31.25%）为优势血清型，未分离到Ⅱ 型、Ⅲ 型和Ⅷ 型，分型率达到100%。其中Ⅵ 型、复合型占75.00%，且Ⅵ 型对16种抗生素耐药率稍高于Ⅶ 型及复合型，Ⅴ 型对16种抗生素100.00%敏感（表4）。

表3 16株大肠埃希菌血清型分布Table 3 Serotype distribution of 16strains of E.coli

表4 优势凝固酶型菌株对16种药物的耐药试验结果Table 4 The drug resistance results of S.aureus of prevalent staphylocoagulase serotypes

3 讨论

奶牛乳房炎是一种以奶牛乳腺组织发生各种不同程度的炎症反应为主要特征的疾病，是奶牛的常见病。根据奶牛乳房及分泌的乳汁有无肉眼可见的变化，可以将奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎（其中隐性乳房炎又称亚临床型乳房炎或非临床型乳房炎）两种，二者可以随着环境和体况的改变发生互相转化。临床型乳房炎症状较轻时造成产乳量和乳品质下降，严重时患病乳区肿胀硬化，乳汁中带血、带脓、大量带菌，甚至会导致乳房失去泌乳能力。每年会有大约10%的患病牛因乳房炎而被迫淘汰［2］。奶牛隐型乳房炎，乳汁的pH＞7.0，偏碱性；乳汁中有凝乳块、絮状物和纤维，无临床症状表现，是临床型乳房炎发生发展的基础。在乳汁检查中的体细胞数量增加（体细胞数大于1.5×106个／mL），乳汁中可以检出致病菌。相对而言，隐性乳房炎在奶牛群体中更加普遍，据统计能够占发病数的75%～95%［3］，由于隐性乳房炎无临床症状表现，并且乳汁无明显异常肉眼可见变化，常被人们忽视。

3.1 细菌分离鉴定

引起奶牛乳房炎的病原菌有20多种［7］，由于区域不同，时间不同或饲养环境的不同，病畜所感染的病原微生物种类也不尽相同。根据病原微生物的传播特点，大体可分为两类，一类是接触传染性病原微生物，另一类为环境性病原体。周庆国等报道，临床型乳房炎中链球菌的检出率远远高于其他致病菌，其中以无乳链球菌为主［8］。链球菌通过链球菌溶血素和致热外毒素对动物机体产生毒副作用［9－10］。也有学者研究称临床病例中，链球菌和金黄色葡萄球菌的出现具有一定的广泛性，国内占90%～95%，国外乳房炎病例中约占74%［11］。其次是大肠埃希菌和念珠菌［12］。本试验中总共分离到110株细菌，其中大肠埃希菌和链球菌61株，所占的比例为55.45%。从试验结果可以看出，牛场患临床型乳房炎的病牛，其病原菌中链球菌的分离率相对较高，金黄色葡萄球菌分离率较低，其中大部分病例乳样中都是2种或2种以上菌共同存在。而试验中所检出的细菌以链球菌为主，包括无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌，占34.5%，远远大于金黄色葡萄球菌的14.5%（表2），与已有报道一致。

3.2 大肠埃希菌血清型分析

奶牛乳房炎大肠埃希菌血清型较复杂，试验表明，23株致病性大肠埃希菌中，有16株已定型，包含9种血清型，其中O13、O17、O18ab、O91和O148较多，为本次分离致病性大肠埃希菌的优势血清型，占已定型菌株的81.25%，另有7株未定型，占分离菌株的30.04%。李玉等［13］对19株奶牛乳房炎致病性大肠埃希菌的血清型研究称O91、O92、O101、O112、O142等为优势血清型，而本试验中鉴定出的O91血清型占定型菌株的18.75%，其余的均未检出；斯木吉德等［14］对245株内蒙古牛源致病性大肠埃希菌的血清型进行鉴定，优势血清型为O60、O89、O119等8种。结果表明，不同地区奶牛大肠埃希菌血清型差异较大，同一奶牛场可存在多个血清型，大多数奶牛场有本场的优势血清型，不同来源的大肠埃希菌血清型也不同，部分菌株有2种以上血清型。

3.3 金黄色葡萄球菌凝固酶分型分析

在日本已经广泛地应用于金黄色葡萄球菌的流行病学研究，目前在我国相关研究报道还很少。本研究采用商品化的凝固酶分型血清确定分离株的血清型别，以了解我国动物源金黄色葡萄球菌的流行状况。试验表明，本次金黄色葡萄球菌凝固酶血清分型率为100%，优势血清型为Ⅵ型与复合型，不同奶牛场优势血清型不尽相同。刘洋等［15］对牛源性金黄色葡萄球菌的凝固酶分型研究，其型别主要分布在Ⅶ型与复合型；有学者对人源革兰阳性球菌耐药监测研究结果表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的优势血清型为复合型和Ⅲ型［16］，丹麦有研究表明Ⅶ型为优势血清型，日本对食物污染溯源的研究称Ⅴ型占优势。本研究结果同时也表明，中国动物源金黄色葡萄球菌凝固酶血清型别的分布比较特殊，有着独特的流行趋势，和国内医源菌株以及国外分离株的差异较大。

3.4 耐药性

从药敏试验结果可知，不同细菌的耐药情况不同，大肠埃希菌对利福平的耐药性最强，耐药率高达100%，但对奥格门丁、阿米卡星和多黏菌素E等敏感性较高；金黄色葡萄球菌对青霉素G和氨苄西林耐药性严重，耐药率在81.25%以上，而对头孢噻呋、先锋唑啉、阿米卡星等8种药物100%敏感；链球菌的耐药率较上述2种稍高，除对万古霉素100%外，对其他15种药物均有不同程度的耐药，且对四环素、克林霉素、阿米卡星等5种药物耐药率在高达52.63%以上。表5中3种优势血清型菌株的耐药情况表明不同凝固酶型的金黄色葡萄球菌耐药状况也有差异，凝固酶Ⅵ型和复合型菌株的耐药情况比Ⅶ型菌株严重，Ⅶ型菌对青霉素G、头孢西丁、氨苄西林和红霉素的耐药率在33% 以上，对其他12种药物均表现100%敏感。凝固酶Ⅴ型菌株对所有测试药物都敏感。所以笔者认为有必要对奶牛乳房炎病原菌进行分离鉴定，交叉用药和有针对性地用药，使之取得最佳治疗效果且避免耐药性的产生。

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