左归丸含药血清通过p38 MAPK信号通路诱导MC3T3-E1成骨细胞的分化

刘立萍 任艳玲 李 然 王智民 赵金茹 蒿长英 宋 囡

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847)

绝经后骨质疏松(PMOP)是以骨量减少、骨组织微观结构改变，骨脆性增强，骨折发生率高为特征的临床常见病症，对于PMOP的防治日益受到人们的关注，现代研究表明中医药在PMOP的药物治疗方面取得了不少成果〔1〕。左归丸具有滋阴补肾、填精益髓作用，本课题组前期研究结果表明左归丸对去卵巢所致PMOP大鼠有一定防治作用〔2〕。为了进一步探讨左归丸治疗PMOP的作用机制，本实验探讨p38 MAPK信号通路对左归丸含药血清调控MC3T3-E1成骨细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 SPF级SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2008-0016。MC3T3-E1 Subclone 14，由中国科学院上海生命科学研究院提供。MC3T3-E1成骨细胞用含10%FBS的α-MEM培养液培养，每周换2次培养液，37℃、5%CO2培养箱内孵育。

1.2 药物与试剂 左归丸(上海雷允上封浜制药有限公司，国药准字Z31020371);倍美力结合雌激素片(爱尔兰惠氏药厂，国药准字 J20050120)，SB203580、PNPP、茜素红(Sigma)，抗ALP抗体(博士德)，抗GAPDH抗体(北京中杉)。

1.3 主要仪器 iMark型酶标仪(Bio-Rad);Trans-Blot SD半干转印系统(Bio-Rad);EC3凝胶成像仪(UVP)。

1.4 方法

1.4.1 含药血清的制备 大鼠按体重随机分为3组，空白对照组、左归丸组、倍美力组，20只/组。根据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸的等临床剂量为1.6 g/kg体重，倍美力为56.25 μg/kg。药物灌服10 ml/kg，空白对照组灌服蒸馏水，2次/d，于第8天给药2 h后，麻醉，腹主动脉取血，室温静置2 h，离心20 min，取血清，56 ℃灭活30 min，过滤除菌，－80 ℃保存。

1.4.2 细胞实验分组 p38 MAPK特异阻滞剂SB203580(10 μmol/L)用DMSO(浓度＜0.1%)溶解。实验分为空白对照组(Control)、SB203580组(SB)、左归丸组(ZG)、左归丸加SB203580组(ZG+SB)、倍美力组(BML)、倍美力加SB203580组(BML+SB)。

1.4.3 碱性磷酸酶活性测定 以1×105接种于48孔培养板，24 h后，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液饥饿24 h，弃培养液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的α-MEM培养液，170 μl/孔，预处理 60 min。各组加入相应的含药血清，30 μl/孔，孵育48 h。0.1%Triton X-100裂解液，4℃作用过夜，转入－20℃，室温解冻，反复冻融3次，冰水浴内超声，收集裂解液，BCA法测定蛋白浓度。采用PNPP法测定裂解产物中的碱性磷酸酶活性，测定孔内加入基质溶液，100 μl/孔，充分混匀37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH 终止反应，80 μl/孔，混匀，酶标仪上415 nm测定光密度值。

1.4.4 改良钙钴法染色 以1×105接种于24孔板，融合达80%，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液饥饿24 h，弃培养液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM培养液，340 μl/孔，预处理60 min。各组加入相应的含药血清，60 μl/孔，孵育7 d，每3 d换1次液。95%酒精固定10 min，PBS洗，加入孵育液，37℃ 孵育4 h，去离子水冲洗，2%硝酸钴溶液5 min，去离子水冲洗，1%硫化铵溶液1 min，去离子水冲洗。

1.4.5 矿化作用分析 孵育14 d，余同1.4.4。95%酒精固定10 min，PBS洗，0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH8.3)37℃，避光孵育30 min，去离子水冲洗。

1.4.6 Western印迹分析 以2×106接种于25 cm2培养瓶，融合达80%，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液饥饿24 h，换用不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM 培养液5.1 ml，预孵育60 min后，各组加入相应的含药血清，0.9 ml/瓶，孵育48 h。提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度，提取液中加入5×SDS上样缓冲液，100℃变性5 min，上样每孔含60 μg蛋白，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜3 h，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。一抗4℃孵育过夜，二抗山羊抗兔HRP 37℃孵育2 h，ECL发光。实验结果采用Quantity one软件分析，扫描光密度值。采用所测ALP蛋白条带与内参GAPDH条带的光密度比值来表示ALP蛋白的表达水平。

1.5 统计学分析 计量数据采用SPSS10.0软件处理，用One-Way ANOVA进行分析，数据以±s表示。

2 结果

2.1 p38阻滞剂对左归丸含药血清干预MC3T3成骨细胞ALP活性和矿化作用的影响 与Control组比较，ZG组和BML组显著增强MC3T3-E1成骨细胞ALP活性和矿化作用(P＜0.01);与ZG组比较，ZG+SB组明显抑制左归丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞ALP活性和矿化沉积的诱导作用(P＜0.01)，且ZG组优于BML组(P＜0.05);与BML组比较，BML+SB组显著抑制倍美力含药血清诱导的MC3T3-E1成骨细胞的ALP活性和矿化沉积(P＜0.01)。见表1。

2.2 p38抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨细胞ALP蛋白表达的影响 与Control组(1)比较，ZG组和BML组均促进MC3T3-E1成骨细胞ALP蛋白的表达(2.395±0.072，1.938±0.023，P＜0.01);与ZG组比较，ZG+SB组显著对抗左归丸含药血清诱导MC3T3-E1成骨细胞ALP蛋白的高表达(1.233±0.058，P＜0.01)，ZG 组优于 BML组(P＜0.01);与BML组比较，BML+SB组显著下调 ALP蛋白表达水平(1.090±0.035，P＜0.01)。SB组 ALP蛋白表达为1.003±0.066。见图1。

表1 p38 MAPK通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞ALP活性和矿化作用的影响(±s)

表1 p38 MAPK通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞ALP活性和矿化作用的影响(±s)

与Control组比较:1)P＜0.01;与 ZG组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01;与BML组比较:4)P＜0.01

组别ALP活性(n=5，nmol·min －1·mg－1)ALP活性(n=3，%)矿化作用(n=3，%)Control 0.247±0.018 1 1 SB 0.185±0.0121) 0.444±0.0731) 0.492±0.0521)ZG 0.477±0.0191) 2.930±0.1241) 3.957±0.0621)ZG+SB 0.355±0.0181)3) 1.717±0.1481)3) 1.050±0.0663)BML 0.381±0.0201)3) 2.763±0.0561)2) 2.967±0.0681)3)BML+SB 0.286±0.0121)4) 1.629±0.0731)4) 1.099±0.0734)

图1 p38抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨细胞ALP蛋白表达的影响(± s，n=3)

3 讨论

PMOP属于中医“骨痿”、“骨痹”范畴，绝经后妇女肾气衰，天癸竭，骨失所养，临床治疗以中医“肾主骨”为基本指导理论，以补肾法为主要治疗法则，选用补肾方药防治PMOP。左归丸作为具有补肾作用的代表方剂，能够有效防治PMOP〔2～4〕。

成骨细胞分化参与骨形成，包括Ⅰ型胶原积累，ALP和骨钙素表达，矿化作用形成矿化结节。成骨细胞增殖受抑制及其分化程度降低，将直接导致骨形成减少，引发骨质疏松〔5〕，刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟是防治骨质疏松的主要方法〔6〕。本实验结果表明左归丸含药血清能够增强MC3T3-E1成骨细胞ALP活性和矿化作用，上调ALP蛋白的表达水平，促进MC3T3-E1成骨细胞分化，参与骨形成，从而有效防治PMOP。

p38 MAPK是促分裂原活化蛋白激酶的亚科，在成骨细胞分化中起着重要作用〔7〕，抗骨质疏松药增强MC3T3-E1成骨细胞的分化和矿化作用〔8〕，甲状旁腺激素能够通过p38 MAPK通路促进成骨细胞骨形成〔9〕，SB203580阻滞p38主要与减少ALP活性相关〔10〕。本研究结果表明SB203580阻滞p38 MAPK通路减少ALP活性和矿化作用，下调ALP蛋白的表达水平，抑制左归丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞分化的促进作用，提示左归丸含药血清可能部分通过p38 MAPK通路影响MC3T3-E1成骨细胞分化，促进骨生成，这可能是左归丸有效防治PMOP的作用机制之一。对于左归丸含药血清是否依赖ERK和JNK通路影响成骨细胞分化，不同MAPK通路对左归丸含药血清促进成骨细胞分化作用的影响是否相同值得我们进一步研究。

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