NADPH氧化酶在肿瘤坏死因子-α致乳鼠心肌细胞肥大中的作用

苏兴利 张 鸿 王 爽 霍 健 郭玉芳 王 湘

(西安医学院基础医学部病理生理学教研室，陕西 西安 710021)

各种病因导致的心力衰竭是老年人死亡的主要原因，肿瘤坏死因子(TNF)-α在心脏疾病细胞因子假说中具有重要的地位，心肌组织可以产生内源性TNF-α，心肌细胞、局部巨噬细胞和血管平滑肌细胞都可以合成〔1〕。Yokoyama等〔2〕给予体外培养的成年猫心肌细胞TNF-α，心肌细胞蛋白合成增加了2.4倍。TNF-α的促心肌细胞肥大作用后来也被其他学者所证实。心衰患者循环中TNF-α的增加被认为是导致心脏功能降低，增加心衰致死率的主要因素。活性氧(ROS)是细胞氧化应激反应产物，研究发现ROS参与了心肌细胞肥大和凋亡，NADPH氧化酶是心肌组织ROS的主要来源。AngⅡ可通过NADPH氧化酶途径促进新生大鼠心肌细胞ROS生成并诱导心肌细胞蛋白合成〔3〕。TNF-α是否也由NADPH氧化酶源性ROS介导了心肌细胞肥大，目前尚未有报道。本研究在体外培养乳鼠心肌细胞，探索NADPH氧化酶在TNF-α诱导心肌细胞肥大中的作用，旨在进一步揭示TNF-α致心肌肥大的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD乳鼠，由西安交通大学医学院动物中心提供。胎牛血清及DMEM培养基、TRIzol(Gibco公司)，TNF-α(R＆D 公司)，夹竹桃麻素(apocycin，APO)、胰酶(Sigma公司)，p22phox兔抗鼠抗体(Santa Cruz公司)，RT-PCR试剂盒(TaKa-Ra公司)，α-actin抗体、SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海生工公司)，RIPA裂解液、活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，内源性过氧化物酶阻断剂(广州深达生物制品技术有限公司)，Image-Pro plus 6.0图像处理软件(美国Media Cybernetics公司)。

1.2 乳鼠原代心肌细胞的培养及鉴定 出生2 d的SD大鼠，无菌取心室肌，反复剪碎，用1.25 g/L胰酶和1 g/LⅡ型胶原酶消化。收集细胞悬液，过滤，以1 000 r/mim离心5 min。用100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接种于培养瓶中。用差速贴壁法分离心肌细胞，置于50 ml/L CO2、37℃孵箱中培养24 h，细胞可出现搏动，免疫细胞化学抗α-actin染色鉴定心肌细胞的纯度。

1.3 实验分组 实验分为4组，每组6孔(n=6)，即正常对照组(A组)，TNF-α 组(B组 80 ng/ml)，APO组 (C组100 μmol/L)和 TNF-α +APO 组，实验重复3次。

1.4 心肌细胞蛋白的BCA法测定 将心肌细胞以5×105个细胞/ml的密度接种于24孔板中，每组6孔，孵育48 h后，吸弃培养基，用PBS洗3次，每孔加入RIPA裂解缓冲液100 μl，充分接触细胞，冰浴下作用5 min后收集心肌细胞，超声破碎细胞，于4℃离心30 min。取上清液，按检测试剂盒的说明操作，计算每孔心肌细胞的蛋白质含量。

1.5 细胞内ROS的测定 DCHF-DA可以自由穿过细胞膜，被胞内酯酶水解生成DCHF，细胞内的活性氧可氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，通过荧光强度反映细胞内的活性氧的水平。将各组细胞用无血清培养基稀释的10 μmol/L DCFHDA避光孵育37℃ 20 min，无血清培养液洗涤细胞3次，激光共聚焦显微镜观察，激发波长488 nm，发射波长525 nm，摄像。用Image-Pro plus6.0软件对图像进行分析，以平均光密度反应ROS的相对含量。

1.6 RT-PCR检测p22phox mRNA的表达 采用TRIzol法提取各实验组细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明，以 Oligo(dT)18为引物，在20 μl体系中合成cDNA。以各组cDNA为模板，分别加入大鼠p22phox上、下游引物进行PCR，GAPDH作为内参照。p22phox上游引物为:5'-TCCACTTACTGCTGTCCGT-3'，下游引物为:5'-TCAATGGGAGTCCACTGCT-3'。GAPDH 上游引物为:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物为:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。25 μl体系反应条件:94℃ 预变性 3 min，94℃ 变性 30s，退火 53℃ (p22phox 基因)，56℃(GAPDH基因)30 s，72℃延伸45 s，共30个循环后，于72℃再延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Chemi-Genius Bio照相系统(Syngene，Cambridge，U.K.)采集图像并进行分析。以样品RNA为模板扩增时未见条带。

1.7 免疫细胞化学染色检测p22phox表达 制作各实验组细胞爬片，经多聚甲醛固定，PBS充分漂洗，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加一抗(p22phox兔抗鼠多克隆抗体，1∶100)，湿盒中4℃过夜，滴加二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。Nikon E200显微镜照相，镜下观察摄像，阴性对照以PBS代替一抗。每组随机选取至少5个高倍视野采集数码照片，用Image-Pro plus6.0图像处理软件进行分析，以平均光密度反应免疫阳性产物含量。

1.8 统计学处理 数据分析采用SPSS15.0软件，实验结果用±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数比较采用ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 乳鼠心肌细胞的鉴定及纯度 倒置显微镜下观察，培养细胞呈圆形或椭圆形，贴壁后细胞为多角形，搏动效果较好，抗α-actin免疫细胞化学染色阳性率大于95%，说明培养细胞主要为心肌细胞，细胞纯度达到实验要求。

2.2 心肌细胞蛋白合成检测结果 给予心肌细胞80 ng/ml TNF-α作用48 h后，心肌细胞蛋白合成与对照组比较，增加了65.8%(P＜0.01)，显微镜下观察，细胞体积增大，说明TNF-α具有刺激心肌细胞蛋白合成，导致细胞肥大的作用。AOP单独作用，对心肌细胞蛋白合成无明显影响，但可将TNF-α促心肌细胞蛋白合成降低89.8%(P＜0.01)。提示TNF-α的作用可能与增强NADPH氧化酶活性有关。

2.3 心肌细胞活性氧水平检测结果 图1所示，TNF-α作用心肌细胞后，与对照组比较，绿色荧光明显增强，ROS含量增加61%(P＜0.01)，APO作用后，荧光较对照组略强。APO可将TNF-α诱导心肌细胞ROS产生的作用降低84.6%(P＜0.01)，提示TNF-α致心肌细胞肥大作用可能与NADPH氧化酶介导ROS产生有关。

2.4 心肌细胞p22phox mRNA表达结果 如图2所示，TNF-α作用心肌细胞后，NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA表达水平明显增加，与对照组比较，表达水平增加65.4%(P＜0.01)，APO组p22phox mRNA表达水平略有下降，APO可明显逆转TNF-α对p22phox mRNA表达的影响(P＜0.01)。说明TNF-α可能通过上调p22phox基因表达介导心肌细胞ROS的产生。

图1 各组心肌细胞ROS生成比较

2.5 心肌细胞p22phox蛋白表达结果 图3可见，TNF-α作用心肌细胞后，NADPH氧化酶亚基p22phox蛋白表达水平明显增加，与对照组比较，表达水平增加112.3%(P＜0.01)，APO可将TNF-α促p22phox表达作用降低91.2%(P＜0.01)。进一步提示TNF-α通过上调NADPH氧化酶亚基p22phox表达水平介导心肌细胞ROS的产生。

图2 各组心肌细胞NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA表达

图3 各组心肌细胞NADPH氧化酶p22phox蛋白表达(×400)

3 讨论

近年来实验和人体研究发现NADPH氧化酶来源的ROS在心血管重塑中具有重要作用。NADPH氧化酶是多种蛋白酶的复合物，可通过催化电子从NADPH转移至分子氧而产生超氧化物。根据催化亚基的不同，分为5种亚型，分别是Nox1～Nox5。Nox1、Nox2和Nox4在心血管细胞表达。与其他来源的ROS，如线粒体、黄嘌呤氧化酶和解偶联的 NO合酶相比较，NAPDH氧化酶主要被特异的激动剂刺激后产生ROS，特别是AngⅡ、ALD、TNFα、TGFβ、PDGF 和机械应力〔4〕。实验证实，NADPH氧化酶来源的ROS在内皮功能障碍、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、RAAS相关的高血压和缺血性血管重塑中发挥重要作用〔5〕。TNF-α是一种具有多种生物效应的细胞因子，在炎症、细胞生存、生长、分化和凋亡等生理和病理过程中具有重要作用〔6〕。结合文献报道和我们前期的研究发现，压力超负荷大鼠心肌组织中TNF-α的浓度升高，并伴随心肌细胞肥大，提示在压力应激下，TNF-α可能以自分泌、旁分泌的方式参与了超负荷下的心肌重构〔7〕。离体实验发现，TNF-α呈浓度依赖性的刺激乳鼠心肌细胞蛋白合成，心肌细胞体积增大。而且TNF-α还可促进心肌细胞内源性分泌AngⅡ，促进心肌细胞AT1受体表达增加，提示TNF-α和AngⅡ都参与了心肌细胞的肥大反应。有研究发现，AngⅡ刺激培养的心肌成纤维细胞，通过NADPH氧化酶p22phox亚基促进ROS产生，可能参与了心肌组织病变的发生〔8〕。在压力超负荷心肌肥厚大鼠模型的实验研究也证实NADPH氧化酶源性的ROS参与了心肌肥大的发生〔9〕。由此提示心肌组织ROS的产生与心肌肥大病变存在密切关系。TNF-α作用于培养的动脉平滑肌细胞，NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA表达增加，ROS生成明显增多，应用反义p22phox cDNA转染平滑肌细胞，则TNF-α不能引起ROS的产生增加〔10〕，这说明TNF-α是通过 p22phox表达增加导致NADPH氧化酶活性增强，而介导ROS产生的。

本研究发现，TNF-α可刺激乳鼠心肌细胞蛋白合成增加，ROS生成增多，引起心肌细胞肥大，应用NADPH氧化酶抑制剂可逆转TNF-α的作用，说明TNF-α通过心肌NADPH氧化酶活性增加导致心肌ROS生成介导了心肌细胞肥大。通过基因水平和蛋白水平的研究提示，NADPH氧化酶活性的增强可能与其亚基p22phox高表达有关。从而表明TNF-α可能是通过增加心肌细胞NADPH氧化酶亚基p22phox表达，导致心肌细胞NADPH氧化酶活性增强，引起心肌组织ROS生成，从而介导了心肌细胞肥大，参与了氧化应激下的心肌重塑。

1 Armstrong EJ，Morrow DA，Sabatine MS.Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes，part I:introduction and cytokines〔J〕.Circulation，2006;113(6):e72-e75.

2 Yokoyama T，Nakano M，Bednarczyk JL，et al.Tumor necrosis factor-alpha provokes a hypertrophic growth response in adult cardiac myocytes〔J〕.Circulation，1997;95(5):1247-52.

3 Nakagami H，Takemoto M，Liao JK.NADPH oxidase-derived superoxide anion mediates angiotensin II-induced cardiac hypertrophy〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2003;35(7):851-9.

4 Griendling KK.Sorescu D，Ushio-Fukai M.NAD(P)H oxidase:role in cardiovascular biology and disease〔J〕.Circ Res，2000;86(5):494-501.

5 Maejima Y，Kuroda J，Matsushima S，et al.Regulation of myocardial growth and death by NADPH oxidase〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;50(3):408-16.

6 Haudek SB，Taffet GE，Schenider MD，et al.TNF provokes cardiomyocyte apoptosis and cardiac remodeling through activation of multiple cell death pathways〔J〕.J Clin Invest，2007;117(9):2692-701.

7 苏兴利，高广道，罗秀成，等.大鼠压力负荷性肥大心肌中TNF-α mRNA表达变化〔J〕.中国病理生理杂志，2004;20(8):1414-7.

8 国 荣，周 娟，邓秀玲，等.心肌成纤维细胞在血管紧张素II作用中活性氧水平及p22phox的表达〔J〕.南方医科大学学报，2009;29(2):202-4.

9 刘 艳，袁祖贻，田雨灵，等.心肌AngⅡ和NADPH氧化酶源性的ROS在心肌肥厚中的作用〔J〕.中国分子心脏病学杂志，2009;9(6):348-52.

10 De Keulenaer GW，Alexander RW，Ushio-Fukai M，et al.Tumour necrosis factor alpha activates a p22phox-based NADH oxidase in vascular smooth muscle〔J〕.Biochem J，1998;329(Pt 3):653-7.