人脐带间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭患者近期疗效与安全性分析*

刘 波 董 静 张骏飞 宋海燕 陈 曦 陈照林 陈从新

国内有学者采用自体骨髓血单个核细胞直接回输法治疗慢加急性肝衰竭患者取得一定的效果，但因所含干细胞数量有限，难以取得更好的疗效[1]。研究表明，人脐带源间充质干细胞(Umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSCs）能够分化为肝细胞样细胞[2]，且免疫原性低，还具备免疫抑制等特性[3]。我们应用UC-MSCs治疗慢加急性肝衰竭患者，观察了近期疗效和安全性，现报告如下。

资料与方法

一、病例选择 2009年～2012年我科收治的慢加急性肝衰竭患者35例，男性28例，女性7例，年龄16～73岁(38.7±15.1岁）。诊断符合肝衰竭诊疗指南[4]。其中早期14例，中期21例。病因诊断为乙型肝炎病毒感染26例，乙型肝炎病毒重叠戊型肝炎病毒感染3例，乙型肝炎病毒重叠甲型肝炎病毒感染1例，乙型肝炎病毒感染伴酒精性肝炎4例，乙型肝炎病毒感染伴药物性肝炎l例。

二、UC-MSCs的分离、培养和表型鉴定 脐带取自本院妇产科健康剖宫产足月胎儿，事先经家属同意并签署捐献同意书。DMEM培养基、胶原蛋白、胶原酶、胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；表皮生长因子、PFGF、地塞米松 、青、链霉素、ITS、HSA均为Peprotech公司产品。CO2培养箱购自美国THMRO公司,倒置显微镜购自奥林巴斯。抗-CD29PE、CD34FITC、CD44PE和CD45FITC购自贝克曼公司。采用贴壁法分离脐带间充质干细胞。取培养至第3代的UC-MSC，制成1×106/ml的细胞悬液，加入荧光标记的鼠抗人PE-CD29、FITC-CD34、PE-CD44和FITC-CD45抗体，用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况[5]。同时取培养基上清行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和艾滋病毒标记物检测，并进行细菌培养、真菌培养、支原体和内毒素检测。间充质干细胞纯度达99%，且各项检测合格后，继续传代备用。

三、治疗方法 患者给出知情同意书，本研究在本院伦理委员会备案，并在中国临床试验注册中心注册(ChiCTR-ONC-12002103）。16例接受UC-MSCs治疗的患者被随机分为A和B两组，每组8例。在综合治疗的基础上（包括应用血制品、预防感染、预防消化道出血、减低门脉压、维持能量代谢和水电解质平衡），A组经前臂静脉进行UC-MSCs移植，B组经股动脉插管行肝动脉移植，移植UC-MSC数量为＞5×107[6]。另19例患者仅接受内科综合支持治疗（C组），3组患者在性别、年龄和病情上无显著性差异。

四、检测和观察项目 采用ELISA法检测病毒标记物(上海科华生物工程有限公司）；使用日立 7600全自动生化分析仪和上海长征医学科学有限公司提供的试剂检测血生化指标；常规检测凝血功能。MELD评分参照文献[5]：R=9.6×ln（肌酐 mg/dl）+3.8×ln（胆红素 mg/dl）+11.2×ln（INR）+6.4×(病因：酒精性为 0，其他为1），结果取整数。

五、统计学方法 数据用SPSS17.0软件进行统计学分析，组间两样本均数的比较采用非参数t检验，并发症发生率的比较采用Fisher概率法。P<0.05为差异具有显著性意义。

结果

一、临床症状、不良反应和转归 细胞移植治疗组患者食欲、体力、腹胀、睡眠等症状在治疗后1周内均自觉有不同程度的改善，而C组患者1周内仅有6例（31.6%）得到改善。在治疗12周时，C组患者7例（36.8%）死亡，而A组死亡1例（12.5%），B组死亡2例（25.0%），明显低于C组（P<0.05）。在随访期间，两组细胞移植患者均未见肝区疼痛、皮肤瘙痒、皮疹、感染等近期不良反应。各组并发症发生情况见表l。

表1 各组患者并发症发生（%）情况

二、各组生化指标和MELD评分的比较UC-MSCs治疗的患者在治疗2周后血清TBIL水平均显著降低，凝血酶原时间缩短，12周后接受UC-MSC治疗患者血浆白蛋白水平显著升高。经前臂静脉细胞移植与经股动脉插管肝动脉移植的两组患者，血生化指标变化无显著性差异，见表2。

讨论

研究表明，UC-MSCs在肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导下，通过特定的细胞信号传导途径，在体外能够分化为有功能的肝细胞样细胞[6]。实验表明，各种理化因素引起的MSCs或肝细胞轻微损伤可以促进MSCs向肝细胞的分化[7]。进一步研究表明UC-MSCs转化后的肝细胞样细胞仍具有低免疫原性[8，9]，这为异基因间充质干细胞的临床应用提供了基础。

我们在本研究中发现，接受UC-MSCs治疗的患者，未见皮疹、出血等移植物抗宿主反应。MSCs间充质干细胞对结构性组织缺损的修复不仅仅依赖其较强的增殖及分化能力，很多研究提示在移植早期，MSCs可能通过旁分泌作用或促进局部祖细胞刺激受损器官残存细胞生长及功能恢复[10]。我们在临床研究中也发现，接受UC-MSCs移植治疗的患者在治疗早期（2周内）就出现了明显的肝脏功能的改善，而此时，增殖、转化的肝细胞样细胞显然还不能达到足够修复坏死肝细胞的能力。但要产生预期的生物学效应，必须要求达到一定数量和密度的MSCs来分泌足够的细胞因子，才能发挥特定的生物学效应[11]。我们在细胞治疗中，移植UC-MSC数量超过5×107个，患者12周生存率达81.2%。在本研究中还观察到，经前臂静脉与经股动脉插管肝动脉MSC移植治疗慢加急性肝衰竭，近期临床疗效并无显著性差异。很多文献也提示，移植后MSCs能分布于多种器官，但能被受损细胞释放的趋化因子吸引至受损局部，并能抑制T细胞反应[12]。研究显示，肝损伤本身能刺激MSC源性肝细胞的形成和长期定植[13]。因此，在应用MSC移植治疗慢加急性肝衰竭时，可能只需外周静脉回输足够数量的MSCs即可达到理想的治疗效果，这样就可避免在肝衰竭情况下经股动脉或门静脉穿刺带来的出血和感染等风险。

表2 各组生化指标和MELD评分(）的比较

表2 各组生化指标和MELD评分(）的比较

与C组比，①P<0.05

例数TBI（μmol/L）Cr(μmol/L）ALB（g/L）INR MELD A组入院时2周后12周后B组入院时2周后12周后C组入院时2周后12周后8 329.3±95.2 177.5±43.8 23.7±6.3 3.1±0.3 36.3±5.1 8 187.5±77.1① 110.3±26.7① 30.8±8.2 1.7±0.3① 26.4±4.0①7 36.8±12.4 70.6±18.6 34.5±5.6① 1.2±0.2 18.6±3.2 8 298.0±86.3 183.1±52.4 24.5±7.6 2.9±0.3 37.6±5.4 8 69.3±65.6① 105.2±34.7① 31.2±6.7 1.8±0.2① 26.1±4.1①6 50.2±15.4① 66.5±20.0① 35.5±3.4① 1.1±0.2① 18.7±3.4①19 313.6±107.4 180.5±50.4 24.8±5.9 3.0±0.4 37.1±5.0 17 259.3±88.5 152.9±38.7 27.8±6.6 2.2±0.3 30.7±4.7 12 43.9±17.2 89.4±25.6 29.5±5.3 1.6±0.3 22.7±3.9

我们采用人UC-MSCs移植治疗慢加急性肝衰竭患者，能不同程度地改善临床症状，降低MELD评分，明显提高了患者近期生存率，未观察到与细胞移植相关的并发症。本组观察例数较少，细胞移植对远期预后的影响也有待进一步验证。

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