基于聚焦离子束的氮化硅纳米孔的制备和表征

武灵芝， 吴宏文， 刘丽萍， 叶晓峰， 刘全俊

1.南京邮电大学地理与生物信息学院，南京 210046；

2.东南大学生物科学与医学工程学院，南京 210096

引 言

纳米孔作为一种新型的纳米探测器，是单分子检测的一项重要技术，其低成本、高通量的特性成为DNA超快速测序实现的关键技术之一[1～5]。1996年，Kasianowicz等人[6]首次报道了α-溶血素(α-HL)蛋白质纳米孔，并检测出DNA和RNA分子过孔产生的阻塞电流。此方法一经提出，就引起了广泛的关注，也是生物膜上各种通道转变为纳米孔的开端。不过，由于生物纳米孔脆弱、不稳定、孔径无法随意控制，限制了它的广泛应用。随着微加工技术的发展，固态纳米孔应运而生。2001年，Li等人[7]首次利用自制的离子束反馈控制系统在Si3N4薄膜上刻蚀出纳米孔，用于DNA检测。随后，Dekker小组[8]利用300 kV的高能聚焦电子束 (focus ion beam，FIB)在SiO2薄膜上刻蚀出纳米孔。随着研究的日趋升温，更多制备固态纳米孔的方法陆续出现，如应用聚焦电子束诱导刻蚀[9～11]、低能电子束刻[12～14]、激光束光刻[15,16]、电化学腐蚀[17～19]等方法，在氮化硅、氧化硅或其它金属氧化物等薄膜介质上制备出稳定的纳米孔。为了得到更小的孔，通过原子沉积[17,18]、离子束沉积[8～10,19]、高能电子束液化[23～25]等进行缩孔的技术也得到发展，以满足纳米孔的应用[17～22]。同时，制备纳米孔的材料也更加广泛，从氧化硅等金属氧化物，到塑料、玻璃、石墨烯等高分子化合物，都成为固态纳米孔的加工材料[10～15,26～30]。固态纳米孔具有稳定性好，尺寸可控，表面特性可调等优势，已成为目前单分子检测领域的研究热点。

不过，固态纳米孔的制备工艺目前仍然比较复杂，成功率和稳定性有待提高，纳米孔的形貌特征也直接影响着纳米孔器件的灵敏度和可靠性。因此，发展一种简单、可靠的纳米孔制备工艺是目前纳米孔器件发展的关键。本文以氮化硅绝缘材料为基底，采用微加工技术设计和制备了自支撑的氮化硅悬空膜结构，然后，利用聚焦离子束 (FIB)刻蚀悬空膜。通过优化聚焦离子束的系统参数，得到一系列孔径和锥度可控的纳米孔。制备好的纳米孔置于膜片钳检测装置中，显示出良好的伏安特性。当加入DNA分子时，电流瞬时下降，得到一系列明显、稳定的阻塞信号。这些结果表明，本文采用的固态纳米孔的制备工艺是切实可行的，该方法制备的纳米孔可以用于不同生物分子的检测和分析，促进其在基因测序，生物传感等领域的广泛应用。

材料和方法

材料

采用4寸晶圆、厚310μm、<100>型双面抛光的单晶硅片为基片，先后通过低压气相沉积分别沉积500 nm SiO2和100 nm Si3N4薄膜。所用硫酸、过氧化氢、氢氟酸、氢氧化钾、氟化铵、乙醇和丙酮等试剂均为分析纯，所用溶液均为去离子超纯水配置(Millipore，>18 MΩ/cm)。

Si3N4膜悬空结构的制备

以4寸晶圆、厚310μm、<100>型双面抛光单晶硅片为基底，通过湿氧化和低压气相沉积，分别沉积500 nm SiO2和100 nm Si3N4的薄膜，然后，腐蚀或刻蚀形成Si3N4膜悬空结构。

掩模版图形的设计

在腐蚀或刻蚀的过程中，利用传统的光刻技术，先在基片上均匀地甩上一层抗蚀剂(也称光刻胶)，然后，通过掩模版在各种波长的光下曝光，将掩模版上的图形转移到光刻胶上。

各层膜的制备

将基片清洗干净后，通过湿氧化的方法在硅片双面生长约500 nm厚的SiO2层，作为过渡层。然后，用化学气相沉积的方法将Si3N4膜沉积在双面SiO2膜上。

各层膜的腐蚀

为了进一步得到Si3N4膜的悬空结构，需要去除掉部分Si和SiO2形成的Si3N4悬空结构。膜腐蚀加工过程如图1所示。 (A)掩膜版图形的转移：在已沉积了膜的Si基片的一面，利用甩胶机均匀地甩上一层光刻胶 (正胶)，用紫外光进行曝光，使暴露在光下的光刻胶发生分解反应，保留未发生分解的光刻胶，从而将掩膜版上的图形转移到光刻胶上。(B)刻蚀Si3N4膜层以及SiO2膜层：光刻版图形转移到光刻胶上后，曝光部分的胶被清洗掉，相应的Si3N4层暴露出来。用CF4/O2等离子体刻蚀Si3N4和SiO2层，最后，用发烟硝酸清洗掉剩下的光刻胶，并用氧等离子体清洗。 (C)腐蚀Si基片：以Si3N4层为保护层，用45%KOH溶液在85℃下将Si层腐蚀，直至另一面的SiO2层为止。 (D)腐蚀SiO2膜：用BHF溶液 (将HF、NH4F和去离子水按照一定比例配置而成)腐蚀SiO2层。通过以上步骤，获得自支撑的Si3N4膜悬空结构。

基于FIB的纳米孔制备

本文采用FEI公司生产的聚焦离子束加工系统，型号为Strata FIB 201，可利用离子束刻蚀出纳米级或微米级的一维或二维结构，以及一定深度的三维结构，或者用离子束诱导化学气相沉积方法沉积纳米及微米级的金属与介电质结构材料。仪器所使用的软件为FEI’sxP2.25，采用Ga69液态金属离子源，加速电压为5～30 kV；离子束流强度为1～11500 pA(分10档)；离子束成像分辨率为7 nm(1 pA、30 kv)；样品台直径为50 mm；离子束通道的真空度保持在10－4Pa，采用spot打孔模式。实验样品为自制的氮化硅悬空薄膜，通过设定不同的FIB作用时间，制备不同孔径的纳米孔，然后通过扫描电镜 (scanning electron microscope，SEM)成像系统对纳米孔进行表征和分析。

DNA过孔实验

制备好的纳米孔用于λ-DNA过孔信号检测。λ-DNA溶解在TE缓冲液中 (10 mmol/L TrisHCl、1 mmol/L EDTA、1 mol/L KCl，pH 8.0，25℃)，浓度为 100 nmol/L。将纳米孔(孔口及孔底直径为15 nm和30 nm，厚度为100 nm)置于检测流体中。如图2所示，装置被氮化硅薄膜分割成两个室，上面的为cis室，下面的为trans室，然后将两个AgCl电极分别置于两个室内，电极引出来与膜片钳 (Axon Instruments，Axopatch 700B)装置连接。当施加电压后，电场分布在纳米孔及其附近。电流信号通过16位的DAQ数字卡采集，采样频率为10 kHz。为了去除电磁噪音，整个流体装置放入Faraday屏蔽箱。DNA分子加入负极的室内后，在电场驱动下，从负极向正极运动，进入纳米孔的捕获区。DNA过同一纳米孔的信号经过多次实验重复，过孔事件通过Labview记录并用Matlab软件分析。

结果和讨论

SEM表征纳米孔

FIB是一种极具潜力的纳米加工工具，可用于离子束曝光、刻蚀、辅助沉积或注入掺杂等[5～10]。本文采用FIB在氮化硅悬空薄膜上打孔，通过设定不同的打孔时间，制备得到十几到几百纳米的孔。如图3显示，当FIB作用时间为15、10、5、3和1 s时，分别得到孔径为41.60、37.94、32.68、26.9和16.67 nm的纳米孔。作用时间太短时，如0.3 s，薄膜未能被击穿。通过大量的实验，我们发现当保持离子加速电压和离子束电流不变，随着FIB作用时间的增加，制备的纳米孔的孔径会不断增大。但孔径的增大和作用时间不是简单的线性关系。随着作用时间的增加，孔径增加的速度逐渐减小。当时间足够长时，孔径并不会无限地增大，而是趋于一个稳定的值。通过对不同厚度的氮化硅薄膜打孔分析，我们发现这一规律同样适用。当离子束电压、离子束电流、离子束通道真空度为定值时，孔径的大小变化与作用时间有关，与薄膜的厚度无关。

通过SEM电镜测得的锥形孔的孔口和孔底直径，以及薄膜厚度，我们得到了纳米孔的锥度角。如图4所示，在设定的打孔条件下，随着离子束作用时间的增长，虽然孔径在增大，但纳米孔的锥度角却越来越小，最终趋近于72°角。这和离子束的能量及入射角等因素是相关的[13,31]。聚焦离子束中镓离子束的能量分布并不是一个严格的点，而是呈高斯分布，离子束中央部分能量较高，然后，逐渐向边缘递减。此外，打孔时，离子束聚焦的位置和离子束的束径也会影响到纳米孔的形貌。

纳米孔的伏安特性

制备好的固态纳米孔置于图2所示的检测装置中，进行电学信号检测。当在纳米孔两侧施加一系列不同强度的正、负电场时，电解质溶液通过纳米孔作定向运动，得到不同的离子电流。图5A为温度为25℃时，不同孔径的纳米孔在1 mol/L的KCl溶液条件下得到的伏安特性曲线，可见孔径增大，得到的离子电流也增大。纳米孔具有一定的整流效应，这主要是由于纳米孔有限的空间使得通过的离子同孔壁表面的电荷发生相互作用，产生了离子优先选择性。当然，离子电流的整流特性不仅与纳米孔的形状有关，而且还与溶液成分、溶液浓度和pH值等因素有关[32,33]。另外，我们对纳米孔的电信号进行了理论预测，发现当纳米孔处于电解质溶液中时，薄膜两侧的电极所测得的响应电流和检测系统的电阻有关，主要包括溶液的电阻及纳米孔本身的电阻。根据Hall对柱形纳米孔的电阻理论，我们对锥形纳米孔的电阻进行了估算[34～36]。按照公式(1)，纳米孔电阻主要包括孔电阻、通道电阻及接触电阻，见图5B。

这里，ρ为溶液的电阻率 (如25℃下，1 mol/L KCl，ρ为0.08953Ω·m)，a和b分别为锥形孔孔口和孔底的直径，d1和d2分别为上、下薄膜的厚度，L为纳米孔通道的长度。通过对不同浓度KCl溶液下得到的实验结果和理论值的比较，证明该公式较好地反映了锥形纳米孔的电阻特性。

DNA过纳米孔

目前，纳米孔主要用于DNA单分子测序，因此，利用制备的纳米孔，我们对λ噬菌体中的脱氧核糖核酸 (λ-DNA，48.5 kbp)进行了检测。λ-DNA的直径为2.4 nm，线性条件下，长达十几微米。当加入DNA分子到负极腔后，DNA在电场驱动下游向正极。如图6A所示，一旦DNA分子进入纳米孔，就会由于体积阻塞效应引起电流的瞬时下降，每一个阻塞信号代表了一个DNA分子过孔事件。从图中可以看出，单位时间内DNA过孔的通量比较高，可达到检测的目的。阻塞信号主要通过阻塞电流 (current blockage)和易位时间(transition time)来表征。阻塞电流是DNA分子在纳米孔中由于体积阻塞效应引起的电流的急剧下降；易位时间是DNA分子穿过纳米孔的时间，主要包括在孔口捕获区与孔相互作用进入纳米孔及在纳米孔内运动的时间。通过对大量过孔事件的统计，得到了如图6B和C所示的阻塞信号的分布直方图。从图中可以看出，阻塞电流和易位时间分别呈高斯分布和泊松分布。当电压为400 mV时，阻塞电流为170 pA，易位时间分布在1～10 ms。易位时间比DNA通过更小孔 (如10 nm和~200-800μs)的时间要长，这可能是因为DNA与纳米孔之间的相互作用引起的。随着驱动电压的增大，阻塞电流逐渐增大，同时过孔速度加快，易位时间减少。考虑到目前DNA过纳米孔测序的主要问题之一就是过孔速度过快，直接影响到过孔信号的采集。因此，我们在增大电压、提高DNA过孔的通量和阻塞电流强度的同时，也要考虑到DNA分子过孔的速度。

总 结

本文利用聚焦离子束在氮化硅薄膜上刻蚀纳米孔，发现通过改变打孔时间等聚焦离子束的系统参数，可以制备出孔径和锥度可控的纳米孔，以满足不同生物分子检测的需求。该方法简单、可靠，制备的成功率比较高。通过SEM和电学信号显示，该纳米孔具有很好的表面特性和伏安特性。同时，我们利用制备的纳米孔对DNA分子进行实验，得到了较高的过孔通量和阻塞信号，进一步证明了基于FIB的氮化硅纳米孔加工工艺的可靠性。随着固态纳米孔制备工艺的不断完善，纳米孔有望发展成为一种方便、快速、廉价的单分子检测技术，给未来生物工程及人类的个性化医疗卫生带来深远的影响。

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