β－桐酸诱导膀胱癌T24细胞凋亡机理

谢 煜 萍，王 晗，孙 仲 琰，叶 淑 红，李 倩，王 际 辉

(大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

多年以来，人们致力于寻找高效低毒的抗癌药物，天然产物共轭亚麻酸由于其多种保健功效成为热点之一。近年来的研究发现其能抑制肿瘤细胞生长，可能的机制包括诱导细胞凋亡，改变信号转导等途径。

β－桐酸(t9，t11，t13－CLnA)是共轭亚麻酸的一种常见异构体，主要存在于桐油及苦瓜籽油中。近年来报道称共轭亚麻酸具有抑制肿瘤形成、提高免疫力、影响脂类代谢和减肥等多种保健功效[1－3]，且研究证明全反式的共轭双键结构如β－桐酸、β－金盏花酸较非全反式的α－桐酸、α－金盏花酸具有更强的抗癌及促凋亡功效[4]。研究发现，β－桐酸对膀胱癌T24细胞的生长有明显抑制作用，但是其具体作用机理尚且不清楚。因此本实验在细胞水平上研究了β－桐酸对膀胱癌T24细胞的凋亡率的影响，以及与凋亡相关蛋白的变化情况，从而探索其凋亡诱导机制。对开发我国天然共轭亚麻酸资源，提高天然共轭亚麻酸资源附加值，发现潜在膀胱癌的药物原料，有着重要的理论和实际意义。

1 实 验

1.1 材料与试剂

人膀胱癌T24细胞，中国科学院细胞库；β－桐酸，瑞典 Larodan Fine Chemicals AB；RPMI－1640细胞培养液，美国Sigma公司；胎牛血清，美国 HyClone公 司；Hoechst 33342、Annexin V／PI凋亡检测试剂盒，杭州碧云天生物技术研究所；MTT，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

CO2恒温培养箱，MCO－17A，日本三洋电机株式会社；超低温恒温冰箱，NU－6382，日本三洋电机株式会社；流式细胞仪，Cell Lab Quanta SC，美国贝克曼公司；倒置荧光显微，AE30／31，厦门Motic公司；酶标仪，TECAN SUNRISE，奥地利TECAN公司。

1.3 实验条件

1.3.1 Hoechst33342荧光染色结果

取对数生长期的膀胱癌T24细胞接种于24孔细胞培养板中，以含有10% 胎牛血清的RPMI－1640培养液培养。加入不同浓度的β－桐酸，继续培养24h，弃去原培养基，用PBS洗涤2次，加入含5μg／mL的Hoechst 33342的培养液，于37℃下孵育10min。在荧光显微镜下观察细胞被标记情况，用紫外光激发，最大激发波长为346nm，发出蓝色荧光，发射波长为460nm。

1.3.2 流式细胞检测

取对数期膀胱癌T24细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。加入不同浓度的β－桐酸，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h，用0.25%胰酶消化细胞，收集细胞，制成单细胞悬液。用PBS将悬浮细胞洗涤2次，用500μL的Annexin V Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V－FITC混匀后，再加入5μL PI，混匀，避光室温反应10min后，利用流式细胞仪进行检测，定量反映细胞凋亡率。

1.3.3 Western Blot实验

取对数期膀胱癌T24细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。取出6孔板，弃旧培养液，加入一定浓度的β－桐酸和T0070907，每种浓度设3个复孔，同时设立对照组。置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养24h。用PBS洗涤后，在冰上向每个孔内加入100μL细胞裂解液，然后迅速刮取蛋白，并离心煮沸分装待用。蛋白被SDS－PAGE分离后，将凝胶上蛋白转膜、封闭，孵育一抗，用PBST洗去非特异性结合一抗；之后孵二抗，再用PBST洗掉未结合的二抗，随后与ECL显色液A、B的混合液相混，经不同曝光时间使胶片感光，最后胶片在定影显影液中显色用于分析。

1.3.4 细胞活力测定

本实验采用MTT法来测定癌细胞的相对活力，将处于对数期生长的膀胱癌T24细胞接种于96孔板上，接种浓度为103个／孔，培养过夜，分别向每孔中加入不同浓度的β－桐酸及PPARγ抑制剂T0070907，作用24h后，除去培养液，向每孔加 MTT(0.5mg／mL)100μL，培养箱内继续培养4h，弃上清液，每孔加DMSO 150μL，振荡，室温放置10min。用酶标仪在570nm波长处检测其吸光度。按公式计算细胞存活率，每组实验至少重复3次：

1.3.5 统计学分析方法

实验数据以平均数±标准差(X±S)表示，采用Origin Pro7.5进行t检验分析。以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 β－桐酸对T24细胞形态的影响

荧光Hoechst 33342染料能特异性结合细胞内DNA，如图1A所示，正常细胞核呈弥散均匀荧光，核膜规整呈圆形，荧光较弱。由图1B～D可以发现，β－桐酸作用浓度20μmol／L时，细胞体积变小，荧光加强，出现凋亡现象；而浓度增至40μmol／L时，细胞核碎裂，染色增强，呈浓染致密的颗粒块状强荧光，凋亡现象显著[5]。结果表明，β－桐酸可以诱导T24细胞发生凋亡。

图1 β－桐酸处理后T24细胞形态学观察Fig.1 Morphology observation of T24cells treated withβ－eleostearic acid

2.2 β－桐酸对T24细胞凋亡率的影响

当不同浓度的β－桐酸(10、20、40μmol／L)分别作用T24细胞24h后，应用流式细胞术检测T24细胞凋亡率显示，对照组凋亡率不足5%，而随着β－桐酸浓度增加，细胞凋亡率显著升高。当β－桐酸的浓度为20μmol／L时，细胞的凋亡率约为50%左右，与对照组相比有显著性差异。当浓度达到40μmol／L时，T24细胞的凋亡率达到78%左右，极大地抑制了细胞活力[6]。这与MTT所得结果相吻合，β－桐酸对T24细胞的生长抑制作用可能是通过诱导其凋亡来实现的。

图2 β－桐酸对细胞凋亡的影响Fig.2 Effect ofβ－eleostearic acid on T24cell apoptosis

2.3 β－桐酸对凋亡相关蛋白表达的影响

Caspase－3作为终端执行者在各种刺激信号诱导的细胞凋亡发挥着重要作用，其表达量的上调被看做是凋亡的重要表现之一[7]，而Bcl－2是一种能抑制细胞凋亡原癌基因，可以通过抑制线粒体释放细胞色素C来抑制细胞凋亡，许多肿瘤中Bcl－2表达均增高[8]。图3为蛋白免疫印迹法检测β－桐酸对T24中凋亡相关蛋白表达的影响。由图3发现，当加入β－桐酸后，Caspase－3的表达量上调，同时Bcl－2的表达量降低，提示β－桐酸诱导了T24细胞凋亡，且可能是通过线粒体途经来完成的。

2.4 PPARγ在β－桐酸诱导T24细胞凋亡中的作用

过氧化物酶体增殖物激活性受体(PPARs)属于家族核酸受体[9]。它们是转录因子，具有调节与脂质代谢的基因转录相关的功能。图3显示β－桐酸处理后，PPARγ的表达呈上升趋势。

图3 β－桐酸对T24中凋亡相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect ofβ－ESA on Caspase－3，Bcl－2，PPARγ protein expression

MTT法检测细胞相对活力，结果如图4所示，与对照组相比，单独加入TT0070907时，对细胞的活力并无影响。当加入的β－桐酸时，能显著降低细胞活力，而当加入PPARγ抑制剂T0070907后，大幅提高了细胞存活率。这与之前的Western Blot实验结果相结合，显示β－桐酸可能通过激活细胞内PPARγ导致细胞发生凋亡，从而抑制了细胞的生长作用。

图4 β－桐酸和抑制剂T0070907对细胞相对活力的影响Fig.4 Effect ofβ－eleostearic acid and T0070907on T24cell vitality

为了进一步研究β－桐酸的凋亡诱导机制，细胞培养液中加入PPARγ抑制剂T0070907后测T24细胞内凋亡相关蛋白的活性，结果如图5所示。随着β－桐酸的加入，细胞内PPARγ蛋白表达量升高，并且Bax／Bcl－2的比值也增大。当加入PPARγ蛋白的抑制剂T0070907后，与未加抑制剂的对照相比PPARγ被显著抑制了活性，且Bax水平下降，而Bcl－2水平上升了，由此推断，PPARγ可能参与β－桐酸诱导T24细胞凋亡的机制中。

图5 β－桐酸及PPARγ抑制剂 T0070907对T24中凋亡相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect ofβ－ESA and PPARγinhibitor T0070907 on apoptotic protein expression

3 结 论

本实验通过Hoechst33342荧光染色和流式细胞术为β－桐酸能诱导膀胱癌T24细胞凋亡提供了有力的证据，且通过蛋白免疫印迹实验结果显示β－桐酸处理T24细胞后，细胞内凋亡相关蛋白 Caspase－3、Bax／Bcl－2的比值和 PPARγ均上调。加入PPARγ抑制剂T0070907后检测细胞活力，发现其能拮抗β－桐酸的作用，显示β－桐酸对T24细胞的凋亡诱导作用可能是通过PPARγ的激活介导的。

本实验为以后其他研究者更深入地研究β－桐酸的抗癌作用机理提供了思路，也为功能性的共轭亚麻酸(CLnA)作为膳食营养补充剂或者潜在抗癌临床药物或辅助药物提供理论依据。

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