高效氯氰菊酯降解菌的筛选及其降解特性

于 晓 菲，夏 清 风，金 朝 霞

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

高效氯氰菊酯，又称β－氯氰菊酯[1]，是一种拟除虫菊酯类杀虫剂。拟除虫菊酯类农药是模拟天然除虫菊酯合成的一类杀虫剂，具有稳定、高效、低毒、杀虫广谱等特点[2]，是目前农业上使用最为广泛的杀虫剂。然而，随着菊酯类农药的长期使用，其在环境中大量残留[3]，并且菊酯类农药半衰期较长，对生态环境和农产品都有污染，影响人们的身体健康[4－5]。此外，菊酯类农药对于家蚕、蜜蜂、水生生物等具有高毒性[6－7]。因此，解决菊酯农药污染已刻不容缓，微生物降解是解决菊酯农药污染 的 重 要 手 段[8－9]。 目 前 对 于 甲 氰 菊 酯[10]、氰戊菊酯[11]、联苯菊酯[8，12]、功夫菊酯[13]等菊酯类均有微生物降解的报道，但关于高效氯氰菊酯特别是浓度较高的高效氯氰菊酯的降解报道较少。为此，笔者筛选出一株能够降解较高浓度高效氯氰菊酯的菌种DL－3，并对其降解特性做了系统的研究，为其在生物修复中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

1.1.1 培养基

无机盐培养基：NaCl、K2HPO4、KH2PO4和(NH4)2SO4各1g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L。

LB培养基：蛋白胨10.00g／L，酵母膏10.00g／L，NaCl 5.00g／L。

高氯菊酯培养基：无机盐培养基经高温灭菌后，加入一定浓度的经滤膜过滤除菌的高氯菊酯。

富集培养基：无机盐培养基中加入0.5%的酵母浸粉。

高氯菊酯／甲醇母液：用甲醇配制终质量浓度为10g／L的高氯母液，装至棕色瓶，阴凉处保存。

1.1.2 试 剂

高效氯氰菊酯原药：有效成分95.4%，南京荣诚化工有限公司

1.2 菌种的富集及筛选

将采自农药厂污水排放口的活性污泥5.0g置于50mL含有100mg／L高氯菊酯的富集培养基中，37℃、170r／min摇床培养7d，以5%的接种量转接至高氯菊酯为200mg／L的富集培养基中培养，依此类推，转接6次使高氯菊酯终质量浓度达到700mg／L。然后用稀释涂布法和划线培养法，于高氯菊酯为100mg／L的无机盐培养基平板上培养获得纯培养物。将纯化后的菌种在含有100mg／L高氯菊酯的无机盐液体培养基中培养7d，验证菌种的高氯菊酯降解效果[8，14]。

1.3 高效氯氰菊酯含量的测定

1.3.1 农药的萃取方法

降解实验定时取样，加入等体积的二氯甲烷，旋涡混合器上充分振荡抽提1min，低温离心10min除菌，取下层有机相检测样品残留农药浓度。

1.3.2 紫外分光光度计测定高效氯氰菊酯含量

菌种初筛阶段，将萃取后的样品用紫外分光光度计在278nm处测定高氯菊酯的含量。

1.3.3 气相色谱测定高效氯氰菊酯含量[15]

测定条件：Agilent 6890GC，ECD检测器，HP－5毛细管色谱柱(30mm×0.25mm×0.25μm)；载气：99.999%氮气，不分流进样；进样口温度280℃，检测温度280℃；柱温采用程序升温：初温150℃，以每分钟25℃升温至260℃，在此温度停留10min。

1.4 菌种的鉴定

1.4.1 16SrDNA鉴定

挑取降解菌单菌落于10μL超纯水中，混匀，于PCR仪中99℃裂解10min，以此裂解液作为菌落PCR的模板扩增菌株的16SrDNA。扩增引物分别为：正向引物：5′－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3′；反 向 引 物：5′－GGTTACCTTGTTACGGCTT－3′[5]。50μL 反应体系：模板裂解液，1μL；dNTPs (10mmol／L)，1μL；10×Taq缓冲液，5μL；引物，各1μL；Taq酶(5U／μL)，0.5μL；超纯水，40.5μL。聚合酶链式反应条件：94℃预变性，4min；94℃，1min；55℃，45s；72℃，90s，循环30次，72℃延伸5min[5]。采用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物后，交由基因公司测序。测序完成获得的结果利用Phylip 3.67软件，采用邻接法，构建菌株的系统发育树。

1.4.2 菌株形态及生理生化特性测定

通过菌株的形态结构及生理生化特性对菌种进行鉴定，生理生化测定参照文献[9－10]。

1.5 各种因素对菌种生长及降解能力的影响

1.5.1 碳源对菌种降解能力的影响

以LB培养基培养的OD600＝1.0的菌种作为种子液，按5%的接种量分别接种于含有1g／L半乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖等的高效氯氰菊酯培养基中，菊酯质量浓度为100mg／L，170r／min、37℃培养7d后测定菌种的生长状况和农药降解情况。

1.5.2 氮源对菌种降解的影响

以5%的接种量将菌种分别接种于含有1g／L(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl、酵母浸粉和蛋白胨的高效氯氰菊酯培养基中，菊酯质量浓度为100mg／L，170r／min、37℃培养7d后测定菌种的生长状况及农药降解情况。

1.5.3 pH对菌种降解能力的影响

以5%的接种量将菌种分别接入pH 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的高效氯氰菊酯培养基中，菊酯质量浓度为100mg／L，培养7d后测定菌种的生长状况和农药降解状况。

1.5.4 温度对菌种降解能力的影响

将菌种种子液以5%的接种量接入100mg／L高效氯氰菊酯培养基中，分别在25、30、37和45℃培养7d，测定菌种的生长情况和农药降解状况。

1.5.5 底物浓度对菌种降解能力的影响

控制高效氯氰菊酯培养基中农药的质量浓度分别为100、200、300和400mg／L，接入菌种种子液，培养7d后测定菌种的生长和农药降解状况。

1.5.6 菌种的降解谱

将菌种分别接入含有100mg／L氰戊菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯的培养基中，培养7d后测定菌种的生长状况和农药降解状况。

以上实验均以相同条件下不接菌的空白样作为对照。

1.6 菜园土壤高氯菊酯农药降解实验

从菜园地中取土壤1kg，喷洒含有高效氯氰菊酯的无机盐培养基，农药的终浓度为100mg／kg，向土壤中倒入经LB培养基培养的OD600＝1.0的菌DL－3悬液5mL，搅拌均匀后自然培养，7d后取样，用二氯甲烷萃取后，测定高效氯氰菊酯含量，计算降解率。

2 结果与分析

2.1 降解菌的筛选与鉴定

通过富集培养分离纯化得到一株能够降解高效氯氰菊酯的菌种，命名为DL－3。在无机盐培养基中，DL－3对高效氯氰菊酯的降解率约为67.5%。DL－3为G＋，短杆状，MR实验阳性，不能以柠檬酸盐和丙二酸盐作为碳源生长，不产苯丙氨酸脱氨酶，产生接触酶，葡萄糖发酵产酸不产气。根据菌株DL－3的16SrDNA序列以及相关菌株的16SrDNA序列构建系统发育树如图1。由图 1 可 知，菌 DL－3 与 菌 株B.anthracisATCC14186以及B.cereusATCC BAA－1005同源性较高，初步鉴定为芽孢杆菌属[16]。

2.2 菌种生长量和农药降解能力的影响

2.2.1 碳 源

在含有高效氯氰菊酯的无机盐培养基中加入不同种类的碳源，菌种的生长量和农药降解率如表1所示。由表1可知，添加额外的碳源能够大大提高菌种的降解能力，其中添加单糖效果最佳，二糖次之，多糖最差。

图1 根据菌种DL－3及相关菌种16SrDNA序列同源性建立的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree based on the 16SrDNA sequences of DL－3and related strains

表1 碳源对菌DL－3生长量和高效氯氰菊酯降解率的影响Tab.1 Effect of carbon source onβ－CP degradation rate and bacterial growth bacterial growth

2.2.2 氮 源

由表2可知，在无机盐培养基中使用硫酸铵在无机氮源中降解率最高，而有机氮源对于菌种降解能力略高于硫酸铵，这可能是由于有机氮源中含有少量碳源，有利于菌种的生长。

2.2.3 温 度

不同温度下农药的降解实验结果如图2。菌种在37℃时对农药的降解率最大，为68.2%；30和45℃时降解率分别为40%和60%；25℃明显抑制了DL－3的降解能力，降解率仅为30%，这可能与细胞中农药降解酶的活性有关。

表2 氮源对菌DL－3生长量和高效氯氰菊酯降解率的影响Tab.2 Effect of nitrogen source onβ－CP degradation rate and bacterial growth bacterial growth

图2 温度对菌DL－3生长量和高效氯氰菊酯降解率的影响Fig.2 Effect of temperature onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.4 pH

pH对菌种降解高效氯氰菊酯的能力影响很大。由图3可知，菌种在pH 7.0时，降解率可达70%，pH 9.0的降解率为40%，而pH 4.0时仅为20%，明显抑制了DL－3的降解能力。

图3 pH对菌DL－3生长量和高效氯氰菊酯降解率的影响Fig.3 Effect of pH onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.5 底物浓度

选取不同浓度的高效氯氰菊酯，降解率的测定结果见图4。结果表明，DL－3对高效氯氰菊酯的降解率随着底物浓度的升高而降低，这可能是由于浓度较高的高效氯氰菊酯对菌种的生长有抑制作用。DL－3能在300mg／L的高效氯氰菊酯中保持55%左右的降解率也是比较少见的。

图4 高氯菊酯质量浓度对DL－3生长量和高效氯氰菊酯降解率的影响Fig.4 Effect of initialβ－CP concentration onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.6 DL－3降解谱的测定

通过DL－3对不同种类拟除虫菊酯农药的降解情况，来判断DL－3对拟除虫菊酯农药的降解是否具有广谱性。表3的结果表明，DL－3对其他菊酯农药的降解率仅略低于对高效氯氰菊酯的降解，因此可以判定DL－3具有广谱性。由于农药残留污染往往具有种类多的特点，DL－3具有一定实际应用价值。

表3 菌DL－3对不同种类菊酯的降解能力Tab.3 Degradation of different pyrethroids by strain DL－3

2.3 菜园土壤高效氯氰菊酯农药降解实验

菜园土壤中农药萃取后利用气相色谱进行分析，高效氯氰菊酯的降解率仅为40%。这可能是菌种对高效氯氰菊酯的降解受外界条件影响较大，菜园土壤中的条件诸如pH、温度、通气情况等，不利于高效氯氰菊酯的降解。

3 结 论

筛选出一株能够以高效氯氰菊酯作为唯一生长碳源的菌种DL－3。DL－3对100mg／L高效氯氰菊酯的降解率为67.5%，经16SrDNA分子生物学和生理生化鉴定确定DL－3为芽孢杆菌属(Bacillussp.)。

添加一定营养成分有利于DL－3对高效氯氰菊酯的降解，DL－3降解菊酯农药的适宜温度为30～40℃，pH 为6.0～8.0。DL－3对高效氯氰菊酯的降解能力随农药浓度增加而减小，高浓度的高效氯氰菊酯对DL－3的生长有一定的抑制作用。DL－3对菊酯类农药的降解具有广谱性。DL－3所产高效氯氰菊酯降解酶以胞内酶为主。

DL－3能在农药质量浓度在200～300mg／L时仍然能保持50%左右的降解率，这在目前农药降解的研究中是比较少见的，同时也为利用微生物解决环境中菊酯农药的污染和残留问题提供了一定的理论依据。但也应该看到，由于土壤环境复杂，菌种的降解能力并不能达到实验室中水平。所筛选的菌种可以通过诱变及基因工程等技术手段，进一步增强其菊酯农药降解能力。

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