阿魏酸甲酯一氧化氮供体在小鼠体内的药动学参数测定

刘颖琳，李燕来，刘浩然，马丽雪

（1.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000；2.湖南大学化学化工学院，长沙 410082）

阿魏酸是临床上慢性肾小球肾炎的治疗药物之一〔1-2〕。一氧化氮在慢性肾病的发生发展中起着重要作用。有研究表明，慢性肾病患者尿中一氧化氮浓度降低。在糖尿病肾病大鼠中，肾脏一氧化氮合成酶（NOS）活力下降，一氧化氮（NO）含量降低〔3-5〕。本课题组合成了三个阿魏酸NO供体衍生物，见图1〔6〕。前期实验表明，其中阿魏酸甲酯供体衍生物（FEND）有较好的生物活性。我们选择FEND测定其在大鼠体内的药动学参数，为进一步研究提供相关依据，现报道如下。

图1 阿魏酸甲酯一氧化氮供体（FMND）

1 材料

1.1 动物 ICR小鼠，雌雄各半，体重20～25 g，购于湖南斯莱克-景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）-2009-0004。

1.2 药品与试剂 阿魏酸甲酯一氧化氮供体（FMND），由湖南大学化学化工学院合成，经HPLC检测，纯度达98.1%；甲醇（色谱纯，美国Tedia试剂公司，批号：101113）；乙腈（色谱纯，美国Tedia试剂公司，批号：101204）；超纯水为自制品；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 岛津高效液相色谱系统：LC-10AT vp二元溶剂输送泵，SP-10A vp紫外检测器；KQ-3200E型超声波清洗器（上海精密仪器仪表有限公司）；WX-8涡旋混合仪（上海沪西仪器公司）；AL204型精密电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），（瑞典Akzo Nobel公司）；检测波长：322 nm；流动相：甲醇－水＝70∶30；流速：1.0 mL/min。柱温：30 ℃。进样量：20 μL。

2.2 血浆样本的制备 ICR小鼠66只，随机分为11组，每组6只，雌雄各半。给药前禁食12 h，自由饮水。将FEND混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中，按50 mg/kg的剂量每组小鼠灌胃，分别于5、10、20、40、60、90、120、180、240、300、420、600 min各断头处死6只小鼠，取血，置于肝素化的EP管中，3000 r/min离心后取上清，备用。取0.3 mL血浆，加入1.0 mL乙酸乙酯，旋涡振荡萃取2 min，8000 r/min离心5 min，吸取有机相，剩余溶液再加入1.0 mL乙酸乙酯，重复提取一次〔7〕。将两次提取的有机相混合，于45℃水浴中在氮气流下挥干有机溶剂，加入流动相100 μL溶解残留物，旋涡振荡l min，尼龙微孔滤膜（0.22 μm）过滤，进样20 μL。

2.3 方法专属性考察 取小鼠空白血浆0.3 mL，按“2.2”项下操作，得空白血浆色谱图。将一定浓度的FEND标准液（12.1 μg/mL）加入空白血浆中，按“2.2”项下操作，得样品色谱图。见图2。

图2 小鼠血浆HPLC谱图

2.4 标准曲线的建立 精密吸取100 μL小鼠空白血浆，置于EP管中，分别加入不同浓度的FEND对照品溶液，分别获得浓度为1.21、2.42、4.84、12.1、24.2、36.3 μg/mL的FEND血浆溶液。按“2.2”项下处理样品，按“2.1”项下的色谱条件进样，每次进样20 μL，记录色谱图。以浓度为横坐标（C），以峰面积为纵坐标（A），进行线性回归，得标准曲线。FEND浓度与峰面积的线性关系为：A=74452.4 C+4322.3，r=0.9994。FMND的检测限达到0.1 μg/mL。在1.21～36.3 μg/mL范围内线性良好。

2.5 精密度试验 配制FEND在血浆中的高、中、低3个不同浓度的样品，于日内及日间测定5次，计算样品测得的浓度。

2.6 萃取回收率试验 取低、中、高3个不同浓度的FMND标准液，一部分经过滤处理后直接进样，另一部分按“2.2”项下处理后进样。计算加空白血浆处理后的样本浓度与直接进样的样品浓度的比值，即为其萃取回收率。

2.7 稳定性考察 将高、中、低3个浓度的FEND血浆样品置于-20℃冰箱，分别于第10、20、30天后再测定其含量。

3 结果

3.1 专属性实验 从图2中可知，FEND的保留时间为6.34 min，达到基线分离，峰形良好，血浆内源性物质不干扰其测定。

3.2 精密度与回收率 结果各血浆样品测定方法的日内及日间精密度RSD均小于2.0%，符合生物样品测定的要求。高、中、低3种浓度的血浆样品的相对回收率均高于85%，RSD均小于2.0%。见表1。

3.3 稳定性 稳定性检测结果表明，FEND血浆样品在-20℃冰箱保存30 d以内变化极小。说明样品至少能在-20℃稳定30 d。

表1 FMND在血浆中的萃取回收率测定（n=3）

图3 ICR小鼠灌胃给予FMND后血药浓度-时间曲线图

3.4 药动学参数 小鼠灌胃给药后，不同时间的平均血药浓度-时间曲线。见图3。用PKSlover 2.0软件对血药浓度－时间数据进行计算，根据（Akaike’s Information Criterion，AIC）选择房室数，以AIC最小者为最优选择。结果FEND经灌胃给药后的药动学行为符合有时滞的二室模型。由药动学参数结果可知，其吸收半衰期为0.94 h，分布半衰期为1.04 h，消除半衰期为9.44 h。时滞为6.6 min。见表2。

4 讨论

4.1 流动相的选择 本实验对FEND的流动相条件进行了考察。当流动相为甲醇－水（70∶30）时，FEND样本能与血浆内源性物质峰分离，且保留时间相对较为理想，峰形良好，适于检测。

表2 ICR小鼠灌胃给予FMND后的药动学参数（n=6）

4.2 血浆样品处理方法的选择 本实验对不同血浆样品处理方法进行了考察。前期实验中曾采用蛋白沉淀法和溶剂萃取法进行处理。以乙腈、甲醇沉淀蛋白的方法进行前处理，发现其回收率只能达到60%左右，乙腈沉淀法回收率稍高。溶剂萃取法则分别采用了氯仿和乙酸乙酯进行处理。发现氯仿萃取后血浆内源性杂峰较多，回收率70%左右。而采用乙酸乙酯萃取回收率达到80%以上，且血浆杂峰较少，故选用乙酸乙酯萃取法。

4.3 药动学结果的探讨 以房室模型为基础，利用软件对几种常见模型进行了拟合。对于房室模型的选择，常以拟合优度参数AIC为重要依据。AIC＝N*InRe+2P，其中N为实验数据的个数，P为所设模型的个数，Re为残差平方和。以一室模型进行拟合，AIC=38.3；以二室模型拟合，AIC=40.88；以有时滞的一室模型拟合，AIC=29.42；以有时滞的二室模型拟合，AIC=29.76。一般以AIC最小者为最优模型。后二者之间AIC相差极小。但考虑到有时滞的二室模型相关系数r=0.9945，而有时滞的一室模型相关系数r=0.9924，最终选择有时滞的二室模型为最佳拟合模型。从药动学参数可以看出，FMND能较快地吸收，分布半衰期并不太长（1.04 h），而消除半衰期较长（9.44 h）。与文献报道的阿魏酸的药动学特点相比〔10-12〕，其吸收速度与阿魏酸相当，而消除半衰期却大大延长。

致谢：中国药科大学药剂教研室张勇博士为本研究提供PK Slover 2.0软件。

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