雷帕霉素对四氯化碳油致肝纤维化模型大鼠的治疗作用

钟志宏，颜文贞，戴 东，陈土明，胡祖超

（1.广东医学院附属医院肝胆外科，广东 湛江 524001；2.广东医学院护理学院，广东 湛江 524023）

雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是1999年美国FAD认定的一种新型大环内酯类免疫抑制剂，RAPA能阻断PI3K/AKT/mTOR细胞通路，具有抑制细胞分化和增殖功能。21世纪以来，RAPA主要应用于器官移植抗排斥，临床实验[1－2]发现：mTOR受体抑制剂能安全、有效地减少肾移植患者的肾毒性。有研究[3－4]表明：RAPA能有效改善肾纤维化，延缓慢性肾病。近年来国内研究表明：RAPA可以改善肝纤维化的进展。本实验应用RAPA、脾切除和RAPA联合脾切除治疗肝纤维化，观察肝和脾组织病理形态学改变、转化生长因子 β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）在肝和脾组织的表达水平以及肝纤维化进展中血清TGF-β1的表达水平，探讨RAPA、脾切除及联合治疗在肝纤维化进展中的作用及其意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 成年健康雄性SD大鼠30只，体质量200～250g，由广东医学院动物实验中心提供，清洁级，大鼠合格证号：44006400000013。采用四氯化碳（CCl4）花生油诱导方法建立大鼠肝纤维化模型，以3mL·kg－1剂量皮下注射体积分数为40%的CCl4油溶液，每周2次，连续8周[5]；CCl4由广东光华化学厂有限公司提供，RAPA购自德国Ruibio公司，Rat TGF-β1双抗购自上海基尔顿生物技术有限公司，TGF-β1 Elisa试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

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.2 动物分组及处理 30只SD大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、RAPA组、脾切除组和联合治疗组，每组6只。肝纤维化模型组、RAPA组、脾切除组和联合治疗组大鼠于6周前均按前述方法建立肝纤维化模型，脾切除组、联合治疗组大鼠于第6周行脾切除，缝合关腹。RAPA组、联合治疗组大鼠于第6周切脾术后禁食完毕同时给予2mg·kg－1RAPA灌胃，每天1次，持续2周。正常对照组、肝纤维化模型组和脾切除组大鼠按同剂量予生理盐水灌胃，每天1次，持续2周。各组大鼠分别于第3、6和8周从眼眶内眦静脉取血1mL，室温凝固30min，于2℃～8℃存放，1 500r·min－1离心15min，取血清于－70°C冰冻保存，检测各组大鼠血清TGF-β1的表达水平。于第8周末处死所有大鼠，取肝和脾组织制作病理切片，行免疫组织化学染色，观察各组大鼠肝和脾组织学改变和TGF－β1表达水平。

1.3 HE染色检测大鼠肝和脾组织的病理形态学

采用HE染色法光镜下检测各组大鼠肝和脾组织的病理学改变。

1.4 各组大鼠肝和脾组织中TGF－β1表达水平的检测 采用免疫组织化学SABC法及DAB显色方法，每张切片取5个视野测定TGF－β1表达，光镜下观察到的棕褐色颗粒为TGF－β1阳性表达产物。采用Image-pro plus 6.0图像分析软件对切片阳性部位进行分析，以积分吸光度（integral absorbtion，IA）表示各组大鼠肝和脾组织中TGF－β1的表达水平，IA值越大表示阳性表达越强。

1.5 ELISA法检测各组大鼠血清TGF－β1的表达水平 根据ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清TGF－β1的表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件处理数据。大鼠肝和脾组织中TGF－β1阳性表达IA值及各组大鼠血清TGF－β1表达水平以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t法。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝和脾组织的病理形态学 肝纤维化模型组大鼠肝脏组织呈混合滴性脂肪变，肝细胞体积增大，排列紊乱，小叶间静脉扩张，部分小叶中央静脉缺如，或纤维间隔明显增生，蜿蜒曲折行向中央静脉方向，可见碎片状坏死区出现在门管区周围或隔周围，内含成纤维细胞，炎症细胞浸润，小胆管增生，部分纤维间隔穿插包绕肝细胞。RAPA组、脾切除组和联合治疗组大鼠均呈现上述改变，但程度有所不同，联合治疗组大鼠肝脏组织损伤明显改善。第8周时，正常对照组、肝纤维化模型组和RAPA组大鼠脾脏组织切片镜下所见：正常对照组大鼠脾脏组织可见淋巴小结、脾索等正常排列；肝纤维化模型组大鼠脾组织出现充血、脾索纤维组织增生和淋巴小结结构变形等；RAPA组大鼠呈现肝纤维化模型组样改变，但程度较轻，结构较清晰。见图1（插页五）。

2.2 各组大鼠肝组织中TGF-β1表达水平 正常对照组大鼠肝组织极少表达TGF-β1（图2A，见插页六）；肝纤维化模型组大鼠和脾切除组大鼠汇管区附近可见大量TGF-β1表达，可见明显纤维间隔（图2B和C，见插页六）；RAPA组与联合治疗组大鼠有不同程度的TGF－β1阳性表达（图2D和E，见插页六）。与正常对照组（9 891.36±1 314.76）比较，肝纤维化模型组（104 239.94±20 890.65）、RAPA 组（27 853.61±2 031.03）、脾切除组（76 957.87±5 053.73）和联合治疗组（14 481.32±4 137.43）大鼠的肝组织中 TGF－β1表达水平明显升高（P＜0.01）；与肝纤维化模型组比较，RAPA组和联合治疗组大鼠肝组织中TGF-β1明显减少（P＜0.01）；脾切除组大鼠肝组织中 TGF－β1表达水平也有所减少（P＜0.05），但以联合治疗组大鼠肝组织中TGF-β1表达水平降低最为明显（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠脾组织中TGF－β1表达水平 各组大鼠脾组织均表达TGF－β1，尤以肝纤维化模型组表达明显。与正常对照组（54 913.91±16 448.19）比较，肝纤维化模型组（153 741.43±41 401.06）大鼠脾组织中TGF-β1表达水平显著增高（P＜0.01）。与肝纤维化模型组比较，RAPA组大鼠，脾组织中 TGF-β1 表达水 平（91 713.57±7 580.52）明显减少，但仍高于正常对照组（P＜0.01）。见图3（插页六）。

2.4 各组大鼠血清TGF-β1表达水平 第3和6周时，肝纤维化模型组、RAPA组、脾切除组、联合治疗组大鼠血清TGF－β1表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。第8周时，与肝纤维化模型组比较，RAPA组和脾切除组大鼠血清TGF－β1表达水平明显降低（P＜0.05），联合治疗组大鼠血清 TGF-β1表达降低更显著（P＜0.01）；与脾切除组比较，联合治疗组大鼠血清TGF-β1水平降低（P＜0.05），但与雷帕霉素组大鼠血清TGF-β1表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TGF－β1表达水平Tab.1 Expression levels of serum TGF-β1of rats in various groups [n＝6，±s，ρB/（ng·L－1）]

表1 各组大鼠血清TGF－β1表达水平Tab.1 Expression levels of serum TGF-β1of rats in various groups [n＝6，±s，ρB/（ng·L－1）]

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs liver fibrosis model group；△P＜0.05 vs splenectomy group.

Group Level of serum TGF-β1 7.52±15.70 Liver fibrosis model 310.24±13.35 358.43±13.62 483.93±52.18 RAPA 302.15±08.38 349.30±18.06 435.16±28.96＊Splenectomy 308.24±73.75 351.94±16.91 444.53±23.40＊Combination treatmant 304.08±11.30 349.53±15.44 406.98±33.41＊＊3 6 8 Normal control 271.07±26.18 270.47±19.32 26（t/week）△

3 讨 论

据世界卫生组织提供的数据，近年来每年全世界死于肝硬化的人数已增加到50万。在发达国家，肝硬化居死亡原因第五位，仅次于恶性肿瘤、心血管疾病、脑血管病和意外事故。研究者[6]认为：晚期肝硬化是不可逆转的，而肝纤维化、甚至早期肝硬化是可逆转的，尤其在当潜在的疾病被根除时。大量的动物实验已经证实：RAPA是一种安全有效的新型免疫抑制剂，2010年RAPA已经进入第Ⅲ期临床试验，更多的研究集中在RAPA器官移植抗排斥反应的作用。近年来在肝纤维化形成机制的研究中，TGF-β1的作用逐渐被发现，TGF-β家族中尤以TGF－β1在肝纤维化的发生发展中有重要的作用[7－9]。

本研究结果显示：肝纤维化模型组大鼠肝、脾组织和血清中TGF－β1表达水平明显高于正常对照组。应用RAPA治疗后，TGF-β1表达水平较肝纤维化模型组均有明显减低。组织病理学研究结果也印证了RAPA组大鼠肝组织纤维化较肝纤维化模型组明显缓解，脾纤维化程度轻于肝纤维化模型组。

王博等[10]研究发现：在不同病因下，脾亢患者的脾组织中TGF－β1高表达，与脾脏淤血纤维化有关联。研究[11－13]发现：脾切除对肝细胞再生有积极作用，可能与肝生长因子（HGF）表达水平的升高和TGF-β表达水平的降低有关联，脾脏分泌的TGF－β1是肝细胞的一个重要抗增殖因子，脾切除术对肝再生功能障碍的人群有益。

本研究结果显示：肝纤维化模型组大鼠脾组织中TGF－β1的表达水平明显高于正常对照组，脾切除组大鼠肝组织中TGF-β1表达水平明显低于肝纤维化模型组，血清中TGF-β1表达水平也有所下降，提示脾切除可以减少肝组织TGF-β1的表达。RAPA组与脾切除组大鼠血清TGF-β1表达水平比较差异无统计学意义，联合治疗组大鼠血清TGF-β1表达水平低于脾切除组。与肝纤维化模型组比较，脾切除组大鼠肝组织的纤维间隔和炎症等情况减轻。RAPA阻断库否细胞（KC）的PI3K/AKT/mTOR信号通路，减少细胞因子TNF－α和TGF-β1等释放，抑制肝星状细胞（HSC）增殖活化。RAPA亦可直接作用于 HSC的Fas/Fasl系统，启动Fas/Fasl凋亡通路，上调P53、下调Bcl-2的表达以诱导 HSC凋亡，抑制 HSC增殖。RAPA治疗肝纤维化的作用机制复杂，其通过多途径、多靶点共同作用以减轻炎症和纤维化。因此，关于肝纤维化的详细机制还有待于进一步研究。

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