Thermotoga neapolitana葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及其酶学性质

毕云枫，刘薇薇，李彦阳，杨万才，沈明浩

（吉林农业大学食品科学与工程学院质量与安全教研室，吉林 长春 130118）

α-葡萄糖苷酶（α－glucosidase，EC 3.2.1.20）

是一种糖苷水解酶，可从底物的非还原端切去α－葡萄糖[1－2]。除了水解酶活力之外，α－葡萄糖苷酶还显示了转糖基活力，催化产物成各种糖基化化合物[3－5]。α－葡萄糖苷酶广泛分布于自然界，如微生物、植物和动物。α－葡萄糖苷酶可以分为3类：类型Ⅰ，水解蔗糖和芳香基糖苷；类型Ⅱ，水解麦芽糖和异麦芽糖能力强，而对芳香基糖苷键水解能力弱；类型Ⅲ，显示和类型Ⅱ相同的水解能力，但是也能水解多糖如直链淀粉和淀粉[6－7]。许多已知的α－葡萄糖苷酶偏好水解α-1，4-糖苷键的底物如麦芽糖和低聚麦芽糖[1]。但来自于Thermus thermophilusstrainGK24和Bacillussp.SAM1606的α－葡萄糖苷酶则更偏好水解α-1，6-糖苷键的底物如异麦芽糖[1，2，8]。真菌来源的 α－葡萄糖苷酶更容易水解链长度较短的底物[9]。大量其他来源的α－葡萄糖苷酶也催化转糖基作用产生糖基化合物[10]。当前研究[11－13]绝大多数是针对微生物α－葡萄糖苷酶，国内外已经有许多的α－葡萄糖苷酶被克隆表达。而嗜热菌因其耐高温，所产酶易纯化、更适合工业的高温反应条件而倍受人们关注。但极端嗜热来源的α－葡萄糖苷酶较少，并大多是以淀粉和麦芽糖为最适底物。新阿波罗栖热袍菌（Thermotoganeapolitana，T.neapolitans，DSM 4359）是一种极端嗜热的海洋细菌，属于热袍菌目。T.neapolitana能够以复杂的碳水化合物为原料产生氢气[14]。因其培养条件要求厌氧且培养温度极高，苛刻的培养条件使其很难大量培养，且产酶量低。本研究从T.neapolitana中成功克隆耐热葡萄糖苷酶，在大肠杆菌中高效表达。并探讨了重组酶的酶学性质。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体T.neapolitanaDSM 4359由Laura Dipasquale教授惠赠，E.coliBL21（DE3）和质粒pET-28a（＋）由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA Polymerase、限

制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自美国TaKaRa公司，细菌基因组DNA提取试剂盒和高纯质粒小量制备试剂盒均购自百泰克公司，柱式DNA胶回收试剂盒、硫酸卡那霉素（Kan）购自上海生工公司，葡萄糖检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，海藻糖、蔗糖和松二糖购自美国Sigma公司，麦芽糖、明串珠菌二糖和龙胆二糖购自TCI公司；其他试剂均为国产分析纯；9600PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，JYP2-Ⅱ超声波细胞粉碎机为宁波新芝生物科技股份有限公司产品，岛津1800紫外分光光度计为日本岛津公司产品。

1.3 LB培养基的制备 LB培养基的组成：1%胰蛋白胨、1%NaCl、0.5%酵母粉、pH＝7.0，于121℃灭菌20min后备用。LB固体培养基的组成：将2%琼脂溶于LB培养基，于121℃灭菌20min。

1.4 基因组DNA的提取T.neapolitanaDSM 4359基因组DNA提取方法按基因组提取试剂盒说明书操作，提取的DNA 1%行琼脂糖凝胶电泳，－20℃保存备用。

1.5 PCR法扩增目的基因 根据NCBI的GenBank中的基因序列（Gene ID：7377508）设计并合成引物，引物中分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点（带下划线部分）。P1引物序列为：5′-CGCGGATCCATGAGGTTGGTCGTCTCTTTTCTTC-3′，内切酶为BamHⅠ；P2引物序列为：，5′-CCGCTCGAGTTATTCTCCAATTTCAACAGAGAAATCC-3′，内 切 酶 为XhoⅠ。以T.neapolitanaDSM 4359基因组DNA为模板，用引物P1和P2扩增目的基因。PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL，引物 P1和 P2各1μmol·L－1，dNTPs 0.25mmol·L－1，模 板DNA约1μg，Taq DNA聚合酶2.5U，灭菌双蒸水补足至50μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50s、54℃退火40s、72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min，反应完成后PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 重组质粒载体的构建 将PCR产物与表达载体pET-28a（＋）经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后切胶回收。将酶切后的葡萄糖苷酶基因片段和pET-28a（＋）质粒按照一定比例混合，并加入ligation T4DNA ligase，16℃下连接2h后4℃过夜。

1.7 重组α－葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的诱导表达

取重组质粒转化至E.coliBL21（DE3）中，涂布于含Kan的LB固体培养基中，37℃培养24h，挑取单菌落于含Kan的LB液体培养基中振荡培养12h，然后以1%的接种量扩大培养，37℃继续培养至对数生长期（600nm波长处的吸光度A600≈0.5），加入200mmol·L－1IPTG 至终浓度为1mmol·L－1，30℃诱导4h。同时诱导空载菌体作为对照。

1.8 非变性丙烯酰胺电泳检测葡萄糖苷酶的表达

将诱导4h的发酵液以10 000r·min－1离心10min收集菌体后，用与原发酵液等体积的结合缓冲液（20mmol·L－1Tris-HCl、200mmol·L－1NaCl，pH 8.0）悬浮菌体，然后进行超声破碎菌体（功率450W，超声处理4s，间歇5s，工作99次），将破碎液在4℃条件下，10 000·min－1离心10min，所得上清液在60℃水浴处理30min，除去杂蛋白于10 000r·min－1离心10min，所得上清液即为酶液。采用非变性丙烯酰胺电泳检测葡萄糖苷酶的表达情况。

1.9 酶活力测定 以海藻糖为底物，溶解于磷酸－柠檬酸缓冲液（pH 5.0），终浓度为2mg·L－1，酶与底物在70℃下保温2h，按照葡萄糖检测试剂盒步骤测定酶活力，使用试剂盒提供葡萄糖制定标准曲线，根据测定的反应产物的A值计算生成的葡萄糖量。每小时催化底物生成1μmoL葡萄糖所对应的酶量定义为1个酶活力单位（U·mL－1）。

2 结 果

2.1 α－葡萄糖苷酶基因的克隆 以T.neapolitanaDSM 4359的基因组DNA为模板，用特异性引物P1和P2扩增葡萄糖苷酶基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，在825bp附近有单一明亮的扩增带，与预期大小相符合。PCR产物由上海生工完成测序，该基因的开放读码框由825个核苷酸组成，编码274个氨基酸。见图1。

2.2 α－葡萄糖苷酶表达载体的构建 重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切并鉴定。重组质粒能被BamHⅠ和XhoⅠ酶切出1条与PCR扩增片段大小一致的片段，同时存在1条片段与pET-28a（＋）大小一致。因此，初步证实目的基因已插入pET-28a（＋）载体中，葡萄糖苷酶的重组表达质粒构建成功。见图2。

图1 葡萄糖苷酶基因的PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoregram of PCR amplification of glucosidase gene

图2 重组质粒的酶切鉴定电泳图Fig.2 Electrophoregram of recombinant plasmid digested by restriction enzyme

2.3 α－葡萄糖苷酶的诱导表达 重组工程菌经IPTG诱导培养后，进行非变性丙烯酰胺电泳，与带有空载PET28a（＋）的E.coliBL21（DE3）比较，重组菌产生一条特异性的蛋白条带，此条带的相对分子质量约为63 000。而空载蛋白中未见此条带。见图3。

2.4 葡萄糖苷酶的最适反应温度 将粗酶液与底物海藻糖在40℃～90℃的温度梯度下反应。以酶活力最高作为100%，计算相对酶活力。重组酶的最适反应温度为75℃，在70℃～85℃范围内相对酶活力较高，均能达到60%活力以上。见图4。

2.5 葡萄糖苷酶的最适反应pH值 在75℃条件下，以海藻糖为底物在pH 3～9这9个不同环境中，用葡萄糖检测试剂盒测定反应。以酶活力最高作为100%，计算相对酶活力。重组酶的最适反应pH值为5.0，在pH 3.0～6.0范围内相对酶活较高。能保持70%以上活力。pH超过6.0时，酶活力迅速降低。见图5。

图3 重组表达的葡萄糖苷酶蛋白电泳图Fig.3 Electrophoregram of recombinant expression glucosidase protein

图4 不同温度下T.neapolitana葡萄糖苷酶相对酶活力Fig.4 Relative activity of glucosidase from T.neapolitana under different temperatures

2.6 葡萄糖苷酶的底物特异性T.neapolitana

葡萄糖苷酶水解糖苷键，水解相关二糖的相对活力为：海藻糖（trehalose）100%、龙胆二糖（gentiobiose）34.01%、 松 二 糖（turanose）7.10%、 蔗 糖（sucrose）6.85%、 麦 芽 糖（maltose）0.50% 和 明 串 珠 菌 二 糖（leucrose）0%。

图5 不同pH值下T.neapolitana葡萄糖苷酶相对酶活力Fig.5 Relative activity of glucosidase from T.neapolitana under different pH values

3 讨 论

从T.neapolitana中克隆表达的葡萄糖苷酶具有极高的耐热特性，利用这个特点，可以利用60℃水浴热处理除去大部分杂蛋白，大大提高酶的纯度。底物特异性实验结果可见：T.neapolitana葡萄糖苷酶对海藻糖的催化能力最强，其次为龙胆二糖，其他二糖的活力均很低或无活力。所以T.neapolitana葡萄糖苷酶能特异性地水解海藻糖的α-（1→1）糖苷键和龙胆二糖的α-（1→6）糖苷键，而对其他糖苷键基本无作用。此前仅见Alarico等[15]报道的Thermus.thermophilusHB27中提取的α－葡萄糖苷酶有此性质。T.neapolitana葡萄糖苷酶还对龙胆二糖的α-（1→6）糖苷键有一定的水解能力。因此，此酶的底物特异性较强。T.neapolitana（DSM 4359）中 Gene ID 为7377508的基因，基因序列提交者将其归为潜在的葡聚糖酶，而本研究结果表明：此酶实际具有α－葡萄糖苷酶性质。α－葡萄糖苷酶有水解多糖、化合物合成、转糖基合成低聚糖和疾病治疗等作用，所以当前被广泛应用于食品、医药和化工等行业。因此将葡萄糖苷酶基因转入到宿主菌中进行高效表达，提高酶得率，降低酶的生产成本，用于转苷生产低聚糖、水解生产多糖等方面具有重要的理论和应用价值。当前的市售α－葡萄糖苷酶多为美国、日本和丹麦等国生产，并且多为不耐热的黑曲霉源。21世纪是绿色的世纪，酶制剂的应用空间巨大。我国α－葡萄糖苷酶尤其是耐热α－葡萄糖苷酶的研究前景非常广阔。

本研究成功地构建了超嗜热海洋热袍菌（T.neapolitana（DSM 4359）葡萄糖苷酶基因的表达载体。诱导表达后的蛋白电泳结果出现特异性蛋白质条带，表明此酶在工程菌中高效表达。酶学性质研究表明：其最适反应温度为75℃，最适反应pH为5.0，对α-（1→1）糖苷键有极强的水解能力。此酶的工程菌的构建成功，为今后此酶的进一步应用和理论研究打下良好的基础。

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