荧光定量PCR检测HCV核酸提取法临床价值分析

张为民 龚文波

丙肝是因感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的病毒性肝炎，主要是通过母婴、血液和体液传播［1］。丙肝病理机制主要为免疫病理损害，因其易发展为肝硬化或肝癌，临床对此疾病重视程度很高。HCV属黄病毒科，拥有单股正链RNA［2］，临床上主要以HCV RNA含量作为丙肝的确诊实验，而常选用的丙型肝炎病毒RNA荧光定量检测试剂盒中上核酸的提取方法通常有两种，即氯仿-异丙醇法和核酸分离柱法。现对两种核酸提取法结果和重复性进行对比，其结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本来源为本院2011年3月至2012年6月间肝炎门诊初步诊断为丙型肝炎患者血清120份。其中男性65人，女性55人。男性平均年龄为(56.2±2.1)岁，女性平均年龄为(55.1±1.9)岁。血清标本内部差异无统计学意义。

1.2 仪器与试剂 Roche公司LightCycler荧光定量PCR分析仪。氯仿-异丙醇法和核酸分离柱法提取试剂及扩增试剂均购自凯杰生物工程(深圳)有限公司，试剂盒最低检测限为5.0×1012IU/mL。检测抗-HCV采用第三代ELISA抗-HCV试剂盒。

1.3 方法 分别按试剂盒的说明书进行RNA提取，然后再使用仪器对其扩增，分析提取效率。重复性检测:取上述中等含量的HCV RNA血清标本1份，分别用上述两种方法各提取核酸8次，进行荧光定量PCR检测，定量结果计算对数值比较两种方法提取的重复性。

1.4 质量控制 每次检验都必须做室内质控，必须在质控范围内，实验结果才可靠，才有研究价值。

1.5 统计学方法 应用SPSS软件对数据进行统计学分析，采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种核酸提取法提取RNA效率比较 两种核酸提取法均以HCV RNA≥1.0×103copies/ml为HCV RNA为阳性标本，两种方法比较结果如表1所示。氯仿-异丙醇法提取RNA阳性率为78.3%，而核酸分离柱法提取 RNA阳性率为81.7%。χ2=0.42，P＞0.05。两者差异无统计学意义，可见两种方法提取RNA的效率接近(核酸分离柱法稍好一点)，都可以较好地提取RNA。

表1 120份标本两种核酸提取法HCV RNA结果对比(n)

2.2 抗-HCV与HCV RNA结果比较 如表2所示。两种方法的HCV RNA与抗-HCV检出率比较，χ2=18.44，P＜0.05(氯仿-异丙醇法);χ2=13.98，P ＜0.05(核酸分离柱法);两种方法差异有统计学意义。

表2120份标本抗-HCV与HCV RNA结果比较(n，%)

2.3 重复性对比 取中等含量的HCV RNA标本1份，分别用两种方法各提取核酸8次，提取完成后进行荧光定量PCR检测，定量结果的对数值分别如表3所示，两种方法的变异系数差异显著，即核酸分离柱法的重复性好于氯仿-异丙醇法。

表3 两种核酸提取法的重复性对比(n，%)

3 讨论

丙肝是因感染丙型肝炎病毒(HCV)引起的病毒性肝炎，传播途径主要有母婴传播、血液传播以及体液传播。丙型肝炎全球都有流行，据世界卫生组织统计，每年新发丙型肝炎病例就有3.5万例［3］。感染HCV可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。研究显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，因此丙型肝炎已成为严重的社会和公共卫生问题［4］。

在丙型肝炎的诊治上，建立针对HCV的高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法具有重要意义，若能早期诊断并治疗，对疾病的预后也有正面影响。荧光定量PCR(RQ-PCR)是是1996年由美国ABI公司推出的一种新定量试验技术［5］，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前RQ-PCR检测HCV RNA在临床已广泛应用，RQ-PCR技术融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点，分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称RQ-PCR为实时荧光定量PCR［6］(real-time quantitative PCR)。其优点较多，敏感、特异、快速、无污染等都是其优势之处。但是荧光定量PCR的实验要求较高，即对采用的样品、试剂都需达到一定的标准才能完成成功检测。其中将核酸提取出来，作为荧光定量PCR反应的模板，这一步相当重要。模板的差异可直接影响PCR扩增效果与HCV RNA的检测结果。

本文通过比较两种核酸提取方法的提取效率与重复性，来为临床选择更好的核酸提取方法，以提高临床上对于HCV诊断。实验结果显示，120份血清标本中氯仿-异丙醇法的核酸提取效率为78.3%(阳性例数为94例)，核酸分离柱法的提取效率为81.7%(阳性例数为98例);两者提取效率相近(核酸分离柱法稍好一点)，都基本可以满足临床的需要，P＞0.05，差异无统计学意义。

在抗-HCV抗体与HCV RNA结果比较中，抗-HCV抗体阳性率显著高于HCV RNA检出率(P＜0.05)，其原因可能是试剂盒因素导致抗-HCV抗体假阳性抑或大多数患者使用的干扰素抗病毒治疗，干扰和抑制了病毒的复制，却不影响其抗体的存在;因此可以知道，单独抗-HCV抗体阳性已不能诊断HCV是否感染，同时也不能作为临床选择抗病毒治疗和监测疗效的依据。血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，检测血清HCV RNA是诊断HCV病毒感染的金标准，而抗体仅作为筛查或辅助判断的指标存在。

在重复性对比试验中，氯仿-异丙醇法的变异系数为38.13%，而核酸分离柱法的变异系数仅为11.98%。两者差异有统计学意义，可知核酸分离柱法的重复性明显好于氯仿-异丙醇法。

综上所述，作者所测的两种HCV RNA提取法，即核酸分离柱法和氯仿-异丙醇法，在RNA提取效率上相差无几，但是在重复性对比中，核酸分离柱法则明显优于氯仿-异丙醇法，并且其避免了使用有毒试剂，对检测人员更安全，因此在临床上更推荐使用核酸分离柱法。在血清检测中，血清是否溶血往往会影响到检测结果，在检测过程中，标本的成分含量差异、生产厂家试剂、采用的不同核酸提取方法，都会影响标本中HCV RNA模板的质量，从而对丙型肝炎的筛查、诊断造成影响。因此，不仅仅是核酸的提取法，临床上对于丙肝的准确诊断，还需在其他方面投入一定精力，以期达到更好的结果。

［1］ 姚磊，张征，黄绍光，等.乙型肝炎不同血清学模式HBV DNA定量检测及其与Pre-S1关系的研究．重庆医学，2006，35(1):60-62．

［2］ 李金明.实时荧光PCR技术．北京:人民军医出版社，2007．

［3］ 刘佳，徐军，王雪飞，等.3种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较．中华检验医学杂志，2008，31(7):780-783．

［4］ 姚航平，夏大静，张立煌，等.慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义．中华检验医学杂志，2001，1(25):49．

［5］ 赵秀丽，单实年，张建琼，等.树状DNA技术在HCV检测中的应用．临床检验杂志，2003，1(21):27．

［6］ 王志明，谭复明，陈伟华，等.输血后丙型肝炎病毒感染的血清病毒定量研究．中华传染病杂志，2000，1(18):37．