红小豆栽培品种胰蛋白酶抑制剂的含量及特性研究

江均平 李春红 张 涛 云冬梅 杨雪丰

(中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室1，北京 100193)

(中国农业科学院作物科学研究所2，北京 100081)

(北京农学院3，北京 102206)

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一类物质，广泛存在于动物、植物和微生物中，在体内能与相应的胰蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动。

现代研究表明，TI对溃疡性结肠炎［1］、辐射损伤［2－3］、HIV 和肿瘤［4－6］等有一定的疗效;农业上，TI可以用于病虫害防治;食品工业，TI可以用来抑制蛋白酶，防止香肠、肉丸、低盐鱼产品、海洋蓝鲹鱼糜凝胶软化［7－8］，改善肉类食品的质构。但是，TI是一种抗营养因子，可降低蛋白质的消化利用，造成胰腺分泌失调性肥大和增生［9］，引起体内含硫氨基酸的内源性散失致使体内氨基酸代谢失调或不平衡。因此，如何科学食用红小豆使之最大发挥保健效果又不抗营养也是需要解决的问题。

红小豆(Vigna angularis)原产于中国，已有2000多年的栽培史，印度、缅甸、朝鲜、日本等国均有栽培，在膳食结构中占有十分重要的地位。临床证实红小豆粉外敷治疗病毒性腮腺炎和化脓性脑膜炎并硬脑膜下积液有特效［10－11］，虽然其治疗机理尚不清楚，但与红小豆中含有大量的胰蛋白酶抑制剂可能有关。红小豆每克含(458.55±5.90)UTI，经90 ℃处理60 min活性未见重要变化，在pH 4～10室温放置30 min未见失活，在 pH 2～3下降约5%［12］，可以作为蛋白酶抑制剂用于食品加工防止凝胶软化，因此红小豆是生产TI的潜在资源。但由于所研究的红小豆种质数量少，尚难全面体现不同种质胰蛋白酶抑制剂的含量及特性。本研究收集了一定数量的红小豆品种，测定了其TI含量，并对3种高产品种TI的种类及稳定性进行了研究，以便为我国红小豆资源的开发利用以及科学食用红小豆提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

18份红小豆品种种子来自我国主产区(2010年产);苯甲酰－DL－精氨酸－对硝基酰胺盐(BAPNA):Sigma公司;胰蛋白酶(1∶250)(Trypsin＞250 N.F.U/mg):Bio Basic Inc.公司。

1.2 仪器设备

TP－114电子分析天平:美国丹佛公司;UV－752紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司;1093 CYCLOTEC旋风磨:瑞典Foss公司;DYY－8C电泳仪:北京六一仪器公司。

1.3 TI的提取

将豆混匀，取约50 g红小豆用旋风磨磨成80目，装于塑料袋，置于冰箱备用。取(1 000.0±1.0)mg红小豆粉用20 mL蒸馏水于150 mL三角瓶中，180 r/min振荡提取1 h(37℃)，12 000 r/min离心10 min得TI提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制剂活力测定

参照 AACC，1999［13］、燕方龙等［14］的方法进行。于试管中依次加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－HCl缓冲液、0.2 mL TI溶液、0.2 mL 0.8 mg/mL 胰蛋白酶溶液(40 mg胰蛋白酶用2 mL 1 mmol/L盐酸溶解，蒸馏水定容至50 mL)，37℃保温5 min后，加入 0.5 mL 0.4 mg/mL BAPNA 溶液(20.0 mg BAPNA用0.5 mL二甲基亚砜溶解，用20 mmol/L CaCl2－0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－ HCl缓冲溶液定容至50 mL，临用前配制)，保温10 min后加入0.2 mL 30%乙酸，混匀，以空白对照(反应时最后加酶液)作参比，测定410 nm的吸光度。抑制率控制在40%～60%。每个样品设3个重复，每个重复设2个平行反应管，以3个重复的平均测定结果±标准差表示样品中TI的含量。

抑制剂活性单位定义:在上述反应条件下抑制1 mg 1∶250的胰蛋白酶活性所需要的抑制剂量为1单位(TIU)。

1.5 高温对抑制剂稳定性的影响

取0.5 mL提取液于离心管中，加入0.5 mL蒸馏水，100℃水浴30 min，然后12 000 r/min离心10 min，取上清液进行电泳及测定残余活性。

1.6 酸性条件对抑制剂稳定性的影响

吸取0.5 mL上清液于离心管中，再加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 1.5 的 KCl－ HCl缓冲液，37 ℃静置8 h，然后进行电泳及测定残余活性。

1.7 TI多型性电泳分析

参照黄国伟等［15］、Felicioli等［16］的方法进行。取(1 000.0±1.0)mg豆粉用50 mL蒸馏水于150 mL三角瓶中180 r/min振荡提取1 h(37℃)，12 000 r/min离心10 min得TI提取液，用蒸馏水稀释5倍，与等体积电泳样品缓冲液混合，取20 μL进行明胶－PAGE。采用不连续垂直平板电泳系统，浓缩胶浓度5%，分离胶12%，2种胶均含0.2%明胶，电极缓冲液为pH 8.3 Tris－甘氨酸，浓缩胶电压80 V，分离胶150 V，电泳毕，用100 mL 胰蛋白酶(25 μg/mL，用脱酶液配制)酶解 20 min(摇床转速 50 r/min、37℃)，然后将酶液倒干尽使凝胶紧贴培养皿，倒置培养皿37℃酶解60～90 min，然后用150 mL脱酶液(0.05 mol/L、pH 7.5 Tris － HCl－0.2 mol/L NaCl－0.01 mol/L CaCl2)分3次漂洗胶板，每次2 min。考马斯亮蓝R－250染色60 min(37℃，摇床转速50 r/min)，0.25 mol/L NaCl溶液脱色。

1.8 统计分析

品种TI含量测定为3个重复，以3个重复的平均值±标准偏差表示。

2 结果与讨论

2.1 红小豆品种TI含量

我国17个红小豆品种TI含量见表1。17个品种 TI含量范围为(236.0 ±13.6)～(541.1 ±12.8)TIU/g，平均值 410.8 TIU/g，品种之间高低相差 2.3倍。电泳酶谱结果显示，红小豆TI含量低于黑大豆，高于绿豆(图1)。

在测试的17个品种中有4个品种超过500 TIU/g，占总数的23.5%。京农21、辽引红豆和XD1 TI含量最高，分别为(541.1 ±12.8)、(531.5 ±7.5)和(528.3 ±14.3)TIU/g，具有潜在的开发价值，故对这3个品种的TI作进一步分析。

表1 不同红小豆品种胰蛋白酶抑制剂含量(TIU/g种子)

2.2 红小豆TI种类

用非变性电泳TI活性染色方法对TI含量最高的京农21、辽引红豆、XD1 TI的种类进行分析，结果见图1。红小豆有7条TI带，其中A4、A2和A6为主带。种植在白城的京农21其A2、A3含量极低或者无，而种植在北京的京红21有A2、A3(图2)，表明种植环境对红小豆TI含量和种类有影响。黄国伟等［15］对1份市售小豆的TI种类进行了分析，发现有7条带。据报道，TI含量与植物品种、生理状态以及受病虫侵害程度有关［17］。

图1 绿豆、红小豆、黑大豆PAGE TI谱

图2 不同产地红小豆PAGE TI谱

红小豆、绿豆、黑大豆3种豆的TI种类不同，绿豆只有4种TI，红小豆有7种，黑大豆有8种。

TI在生物体内担负多种生理功能，需要不同种类及丰度的TI才能满足要求，豆类TI多型性的生物学意义值得深入研究。

2.3 红小豆TI热稳定性和酸稳定性

经沸水处理30 min或经pH 1.5处理8 h，3种红小豆TI的活性可以保存92.2%以上(表2)。Gelatin－PAGE TI谱分析表明，经热处理或酸处理，京农21的A7的活性下降明显，其他TI带稳定;辽引红豆7条带均较稳定;XD1中7种TI对酸较稳定，对热稳定性稍差(图3)。Klomklao等［12］报道红小豆TI经90℃处理60 min活性未见重要变化，在pH 4～10室温放置30 min未见失活，在pH 2～3下降约5%。据报道，红小豆TI由82个氨基酸残基组成，分子中含有7对二硫桥［18］，故具有很高的热稳定性和酸稳定性。

表2 红小豆TI稳定性

图3 热、酸处理红小豆PAGE TI谱

这些结果表明红小豆TI耐热、耐酸，可以应用于各种食品热加工工艺，口服时胃酸也不会导致失活，具有潜在的应用价值。

3 结论

我国红小豆品种平均含 TI 410.8 TIU/g，有23.5%的品种其TI含量超过500 TIU/g，表明我国有大量高产TI的红小豆资源。红小豆TI耐热耐酸，有可能用于各种热加工工艺防止蛋白酶引起软化，胃中pH不会破坏其活性，是生产TI的潜在原料;红小豆含7种TI，比绿豆多4种，生长环境对TI的种类和含量有影响。

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