粮食水溶性蛋白组成特点及体外结合胆酸盐能力比较

吴继美 吴清楠 李任强

(暨南大学生物工程学系，广州 510632)

胆固醇是血脂的成分之一，参与形成细胞膜，是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料［1］，为人及动物细胞不可缺少的重要物质。但高胆固醇被认为可引起冠心病等疾病。胆酸盐是胆固醇分解后的产物，吸附胆酸盐并将其排出体外可降低胆酸盐在肝肠循环中的积累，从而促进胆固醇降解代谢，达到降胆固醇、降血脂的目的，所以能吸附胆酸盐的物质有利于降血脂。许多研究已证明食物中的一些物质能与胆酸盐结合，其中蛋白质也是能与胆酸盐结合的物质之一。如Yoshie－Stark等［2］对羽扇豆蛋白及其水解产物在体外结合胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的能力进行测定，显示酸溶性蛋白的结合能力最强;Barbana等［3］研究了扁豆面粉，扁豆浓缩蛋白和小扁豆蛋白水解物在体外与胆酸盐的结合，显示除了脱氧胆酸钠，对其他胆酸盐的结合，小扁豆蛋白水解之后的产物结合胆酸盐的能力最强。Kayashita等［4］通过动物试验发现荞麦蛋白提取物能增加小鼠排泄物中中性甾醇的含量，认为荞麦蛋白具有降低胆固醇的能力。周小理等［5］通过体外吸附胆酸盐能力的测定证实所提取分离得到的苦荞水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。Kongo－Dia－Moukala等［6］研究经过5种不同蛋白酶消化的脱脂玉米蛋白水解产物与甘氨胆酸钠、胆酸钠和脱氧胆酸钠的结合能力，结果显示脱脂玉米蛋白经过不同的蛋白酶消化后与胆酸盐的结合能力不同，但结合能力最强的大部分肽的分子质量为180～500 u。Kahlon等［7］研究体外胆汁酸结合米糠、燕麦麸、脱壳大麦和β－葡聚糖富氧大麦的能力发现，在相同蛋白物质的基础上，米糠和去壳大麦吸收量相对较高。

稻谷、小麦、大豆、玉米、马铃薯和甘薯等是人类的主要粮食，关于它们组成的一些成分的降血脂功效已有较多报道，但针对这些粮食水溶性蛋白与胆汁酸(盐)结合能力的研究报道甚少。所以，本研究的目的是提取这些粮食的水溶性蛋白，分析它们的组成特点及其在体外与胆酸盐结合的能力，以期了解这些粮食的保健价值等。研究对于更深入的了解这些主要粮食的特性及其与饮食健康之间的关系有很好的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂、仪器

1.1.1 粮食原料

甘薯:广薯155，广东，2012年产;玉米:粤甜13号，广东，2012年产;稻谷:籼米，广东，2012年产;大豆:普通黄豆，吉林，2012年产;马铃薯:鲁引1号，山东，2012年产;小麦:济麦22，山东，2012年产。

1.1.2 主要试剂

Sephadex－G75:Pharmacia公司;胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠和牛血清白蛋白:美国Sigma公司;硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、石油醚等均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

Gold spectrumlab54紫外可见分光光度计:上海棱光技术有限公司;DS－1高速组织捣碎机:上海标本模型厂;Thermo BR4i高速冷冻离心机:Thermo公司;Scientz－10N冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司;MALAYSIA漩涡振荡器:电热恒温水浴锅:上海悦丰仪器有限公司;电泳仪:BIO－RAD;FR－980生物电泳图像分析系统:上海复日科技公司;Delta 320型精密pH计:梅特勒－托利多上海公司。

1.2 方法

1.2.1 水溶性蛋白的提取［8］

分别取适量的大豆、大米、玉米、小麦干粉，加约2倍(V/m)石油醚在4℃下搅拌1 h脱脂，4 000 r/min离心30 min去上清液。样品风干后用约4倍(V/m)蒸馏水在4℃下搅拌2 h，离心取上清液，加95%饱和度的硫酸铵进行盐析，静置0.5 h后离心去上清液，蒸馏水溶解沉淀，用蒸馏水透析得水溶性蛋白样品。新鲜的马铃薯和甘薯清洗干净，称量切成小块加少量蒸馏水置于组织捣碎匀浆机中匀浆，离心取上清液，加95%饱和度的硫酸铵进行盐析，静置0.5 h后离心去上清液，蒸馏水溶解沉淀，用蒸馏水透析得水溶性蛋白样品。

1.2.2 水溶性蛋白提取液的蛋白含量测定［9－10］

采用紫外(UV)吸收法［9－10］测定各样品蛋白质含量。分别取牛血清白蛋白标准溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 定容于 10 mL 容量瓶中，用紫外可见分光光度计测定280 nm处吸光度。以牛血清白蛋白浓度为横坐标，溶液吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出标准直线方程。测定各粮食蛋白样品在280 nm处吸光度，根据标准曲线方程计算样品蛋白质含量。按公式:计算蛋白提取率。式中:Q为提取率/%;c为提取液浓度/mg/mL;V为提取液体积/mL;m为样品初始质量/g。

1.2.3 样品蛋白的电泳鉴定［11］

使用还原性十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)进行电泳鉴定各样品的蛋白。电泳分离胶体积分数为12%，浓缩胶体积分数为5%。利用电泳系统对电泳结果进行密度扫描等分析。

1.2.4 样品吸附胆酸盐能力的测定

首先参照文献［12］方法略作修改进行胆酸盐含量标准曲线的测定。以0.1 mol/L、pH 6.3的磷酸缓冲液分别配置0.9 mmol/L的胆酸钠(SC)、脱氧胆酸钠(SDC)和牛磺胆酸钠(STC)的标准液。分别取上述标液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加入 0.1 mol/L、pH 6.3的磷酸缓冲液至2.5 mL，然后加入7.5 mL质量分数为60%的硫酸溶液，于70℃水浴20 min，冷却后分别对同浓度的SC、SDC和STC样品进行全波长扫描确定最大光吸收值时的波长都为377 nm，所以测定各样品在377 nm波长处的吸光度绘制标准曲线，得出各胆酸盐含量标准直线方程。

参照文献［10］和［12］方法略作修改测定样品蛋白结合胆酸盐的能力。分别取各样品水溶性蛋白液1 mL于10 mL具塞试管中，加入1 mL 0.01 mol/L的HCl，在37℃恒温振荡消化1 h，以0.1 mol/L的NaOH调pH 6.3，每个样品中分别加入4 mL胆酸盐标准液(依次测定SC、SDC和STC)，在37℃恒温振荡1 h后转入离心管，以10 000 r/min离心10 min，上清液为分析液。分别取分析样液2.5 mL于10 mL具塞试管中，加入7.5 mL质量分数60%的硫酸，于70℃水浴20 min，取出冷却，测定在377 nm处的吸光值，由标准曲线求得样液中胆酸盐的浓度。以所加入胆酸盐的浓度减去此浓度即为被蛋白结合了的胆酸盐的浓度，计算单位质量的蛋白质结合胆酸盐的能力。每个样品的测定做多次重复，进行数理统计。

1.2.5 数据分析

采用Microsoft Office Excel 2007制作标准曲线以及折线图。水溶性蛋白含量测定以及蛋白质提取率重复3次;胆酸盐吸附测定重复4次;对结果均以平均值±标准差(±s)表示。采用spss16.0数据统计软件对胆酸盐结合量进行方差分析;各组间比较采用One－Way ANOVA单因素方差分析。P＜0.05为差异显著、P＜0.01为差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与讨论

2.1 水溶性蛋白的提取和鉴定

蛋白质含量测定的牛血清白蛋白标准曲线的相关系数 R2=0.998 7，直线方程为 y=0.456 2x+0.000 1。根据直线方程计算6种粮食提取液的水溶性蛋白质浓度，按照1.2.2中的公式计算提取率的结果列于表1。从表1可见，大豆的水溶性蛋白含量最高，济麦22品种的小麦次之，而鲁引1号品种的马铃薯相对较低。

表1 各样品水溶性蛋白的浓度及提取率(±s，n=3)

表1 各样品水溶性蛋白的浓度及提取率(±s，n=3)

注:﹡大豆、玉米、大米和小麦的提取率以干粉计算，马铃薯和甘薯的提取率以湿重计算

样品 大豆 玉米 大米 小麦 马铃薯 甘薯质量浓度/mg/mL 8.51 ±0.020 7.34 ±0.010 8.18 ±0.017 8.37 ±0.023 8.56 ±0.019 8.45 ±0.031﹡提取率 g/100 g 7.92 ±0.320 1.12 ±0.021 1.37 ±0.017 3.34 ±0.016 0.13 ±0.021 2.10 ±0.036

对各样品水溶性蛋白进行SDS－PAGE结果如图1(5次电泳，取质量最好的电泳图标出)。对电泳图蛋白进行密度和条带扫描分析，得到表2。从图1可以看出，各样品的蛋白组成差异较大，籼米、大豆、和济麦22品种的小麦的蛋白种类较多，广薯155品种的甘薯的蛋白种类最少。明显的，相对分子质量小于44.3的蛋白是构成6种粮食水溶性蛋白的主要成分，而其中相对分子质量小于29 ku的部分占的比例较高，特别是广薯155品种的甘薯，相对分子质量小于29的蛋白占的比例高达94.7%。

图1 6种粮食水溶性蛋白SDS－PAGE图谱

表2 6种粮食水溶性蛋白条带数及按分子量质大小的组成的质量分数/%(n=5)

2.2 水溶性蛋白与胆酸盐结合的能力

由于广薯155品种的甘薯水溶性蛋白组成成分较简单，大小相对分子质量的蛋白相差大，所以通过Sephadex－G75分子筛处理得出相对分子质量较小部分的蛋白如图2。此蛋白和6种粮食水溶性蛋白一起测定它们与胆酸盐的结合能力。

胆酸盐含量标准曲线的测定得出:胆酸钠的直线方程为 y=0.911 6x－0.029 3，相关系数 R2=0.992 8;脱氧胆酸钠的直线方程为 y=0.808 9x－0.028 1，相关系数 R2=0.986 5;牛黄胆酸钠的直线方程为 y=0.331 1x －0.014 2，相关系数 R2=0.993 1。都具有良好线性，符合要求。6种粮食样品水溶性蛋白及广薯155品种的甘薯相对分子质量较小蛋白对胆酸盐的结合能力测定结果列于表3。

图2 广薯155品种的甘薯相对分子质量较小部分的蛋白SDS－PAGE图谱

表3 6种粮食水溶性蛋白及甘薯低相对分子质量蛋白对各种胆酸盐的结合能力(n=4)

根据表3按结合能力大小顺序作出6种粮食水溶性蛋白与3种胆酸盐结合的折线图，如图3。

图3 6种粮食水溶性蛋白吸附胆酸盐能力比较

图3横坐标表示6个粮食品种，纵坐标表示6种粮食水溶性蛋白的胆酸盐结合量。可见，6种粮食水溶性蛋白对胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠都有吸附能力，但对胆酸钠、脱氧胆酸钠的吸附力相对较好，而对牛磺胆酸钠的吸附力较弱，这与前人的研究结果相吻合，因为牛磺胆酸钠是一类较难被吸附的结合型胆酸盐［13］。在6种粮食中，济麦22品种的小麦水溶性蛋白对胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠这3种胆酸盐都表现出最大吸收量，与其他5种粮食相比具有极显著差异(P＜0.001)，为高质量的蛋白。由数理统计分析得出:相同单位重量的蛋白对胆酸钠的吸附能力是，小麦＞玉米＞大米＞大豆＞马铃薯＞甘薯，其中，济麦22品种的小麦吸附能力显著性高于其他样品，籼米和大豆、籼米和粤甜13号品种的玉米之间吸附能力无显著性差异，但这三者与鲁引1号品种的马铃薯、广薯155品种的甘薯之间有显著性差异，鲁引1号品种的马铃薯和广薯155品种的甘薯之间吸附力也有显著性差异。吸附脱氧胆酸钠的能力是，小麦＞大米＞玉米＞大豆＞马铃薯＞甘薯，各样品水溶性蛋白吸附力之间有显著性差别。吸附牛磺胆酸钠的能力是，小麦＞大米＞大豆＞玉米＞马铃薯＞甘薯，除了鲁引1号品种的马铃薯与广薯155品种的甘薯之间外，各样品之间的吸附力都有显著性差异。以总的对3种胆酸盐吸附能力进行比较，小麦＞大米＞玉米＞大豆＞马铃薯＞甘薯，济麦22品种的小麦最好，极显著性高于其他粮食，但籼米和粤甜13号品种的玉米之间、粤甜13号品种的玉米和大豆之间的吸附力无显著性差异，而鲁引1号品种的马铃薯、广薯155品种的甘薯则显著性低于其他样品。

分析各粮食水溶性蛋白组成的特点与它们吸附胆酸盐能力之间的关系可以看出，蛋白的组成种类与吸附力相关，不同的蛋白组成种类使各样品表现出不同的吸附力，鲁引1号品种的马铃薯和广薯155品种的甘薯水溶性蛋白种类较少，吸附胆酸盐的能力也较小。

吸附胆酸盐能力较强的济麦22品种的小麦、籼米、粤甜13号品种的玉米和大豆等4种粮食的水溶性蛋白组成的特点是不仅种类多，而且小相对分子质量的蛋白占的比例较大。小于44.3相分子质量的蛋白在组成上占了绝大部分(表2)。广薯155品种的甘薯小分子质量蛋白对3种胆酸盐的吸附能力都大于广薯155品种的甘薯总的水溶性蛋白(表3)，这可能说明，总的来说小相对分子质量水溶性蛋白吸附胆酸盐的能力更好。胆酸和脱氧胆酸约占人体总胆酸盐的30%和20%，且在人体内一般以钠盐的形式存在，而牛磺胆酸钠是一类较难被吸附的结合型胆酸盐［13］。水溶性蛋白对胆酸钠和脱氧胆酸钠的吸附力明显的高于对牛磺胆酸钠的吸附力，既因为牛磺胆酸钠是一类较难被吸附的结合型胆酸盐外，又可能由于胆酸钠和脱氧胆酸钠分子中含有羟基能更有效地与水溶性蛋白的羟基和氨基以氢键形式相互作用，从而达到更稳定高效的吸附效果［13－14］。

在烹饪或加工过程中，粮食的水溶性蛋白较易损失。本研究结果可加深对这些主要粮食的水溶性蛋白价值的认识，为合理进行这些粮食的处理、提高它们的价值和开发利用粮食水溶性蛋白提供了有意义的数据。

3 结论

通过分析稻谷、小麦、大豆、玉米、马铃薯和甘薯等6种主要粮食水溶性蛋白的组成特点和提取率，说明了大豆水溶性蛋白含量最高，小麦次之，马铃薯最低;稻谷、大豆和小麦的水溶性蛋白组成种类多，而马铃薯和甘薯则组成种类少。测定这些蛋白样品在体外生理pH 6.3条件下与胆酸盐结合的能力和进行数理统计，证明了这6种粮食水溶性蛋白对胆酸钠、脱氧胆酸钠具有较好的吸附作用，对牛磺胆酸钠吸附作用较弱。相同蛋白质量情况下，小麦水溶性蛋白吸附胆酸盐的能力最强，极显著性地大于其他5种粮食;稻谷和玉米之间、玉米和大豆之间的吸附力无显著性差异，而马铃薯、甘薯则显著性低于其他样品。这些粮食水溶性蛋白吸附胆酸盐能力的差异主要与蛋白组成有关，蛋白种类少吸附能力也小，低相对分子质量水溶性蛋白对胆酸盐的结合能力可能比高相对分子质量的水溶性蛋白要强。

［1］Kobayashi M，Ikegami H，Fujisawa T，et al.Prevention and treatment of obesity，insulin resistance，and diabetes by bile acid －binding resin［J］.Diabetes，2007，56(1):239 －247

［2］Yoshie－Stark Y，Wasche A.In vitro binding of bile acids by lupin protein isolates and their hydrolysates［J］.Food Chemistry，2004，88(2):179 －184

［3］Barbana C，Boucher A C，Boye J I.In vitro binding of bile salts by lentil flours，lentil protein concentrates and lentil protein hydrolysates ［J］.Food Research International，2010，44(1):174 －180

［4］Kayashita J，Shimaoka I，Nakajoh M，et al.Consumption of buckwheat protein lowers plasma cholesterol and raises fecal neutral sterols in cholesterol－Fed rats because of its low digestibility［J］.The Journal of Nutrition，1997，127(7):1395 －1400

［5］周小理，黄琳，周一鸣.苦荞水溶性蛋白体外吸附胆酸盐能力的研究［J］.食品科学，2011，32(23):77－81

［6］Kongo－Dia－Moukala J U，Zhang H，Irakoze P C.In Vitro binding capacity of bile acids by defatted corn protein hydrolysate ［J］.International Journal of Molecular Sciences，2011，12(2):1066－1080

［7］Kahlon T S，Woodruff C L.In vitro bile acid binding capacity of milled wheat bran and milled extruded wheat bran at five specific mechanical energy levels［J］.Cereal Chemistry，2006，83(4):434 －438

［8］郭晓娜，姚惠源.苦荞麦抗肿瘤蛋白的分离纯化及结构分析［J］.食品科学，2007，28(8):462 －465

［9］陈雅蕙，余瑞元.生物化学实验原理和方法［M］.北京:北京大学出版社，2005:246－249

［10］辛勋，卢红云.紫外分光光度法测定速效伤风胶囊中的胆酸含量［J］.中国药业，2000，9(1):36－37

［11］陈雅蕙，余瑞元.生物化学实验原理和方法［M］.北京:北京大学出版社，2005:262－267

［12］邓志汇，黄惠华.茶鲜叶和茶花水提液对胆酸盐的结合及其降血脂机理的研究［J］.食品科学，2011，32(19):96－99

［13］Debruyne P R，Bruyneel E A，Li X D，et al.The role of bile acids in carcinogenesis［J］.Mutation Research－Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2001，480(SI):359－369

［14］杨林，陈家厚，张兰威，等.大米蛋白对幼鼠血清胆固醇水平的调控效果及作用机制的研究［J］.现代预防医学，2009，36(6):1051 －1053.