反相高效液相色谱法测定O/W型二氢青蒿素脂肪乳剂中二氢青蒿素含量＊

王 荧 ，马玉樊 ，卢婷利 ，陈 涛 ，2，3

(1.西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072; 2.陕西脂质体工程技术研究中心，陕西 西安 710075;3.西安力邦制药有限公司，陕西 西安 710075)

青蒿素是从菊科植物黄花蒿中提取分离的一种有效的新型倍半萜内酯化合物，具有过氧桥结构。二氢青蒿素由青蒿素C－10羰基还原得到[1]，具有快速、高效、低毒性的特点，同时可以预防和治疗血吸虫病，抗肿瘤及皮肤病等多种疾病，是值得开发且具有良好应用前景的中药品种[2－7]。但由于其水溶性差、生物利用度低，目前研究的新型载药体系如脂质体、微球并不能增强二氢青蒿素的抗疟效果[8－12]。因此，为提高二氢青蒿素的生物利用度及其抗疟效果，笔者将二氢青蒿素包封于脂肪乳油相中，制成O/W型脂肪乳剂，且采用反相高效液相色谱法测定二氢青蒿素脂肪乳制剂中二氢青蒿素的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters2695型高效液相色谱仪，包括Waters2996型紫外检测器，Waters 717型自动进样器，WatersMillennium色谱工作站;实验型高压均质机NS 1001L型(意大利Niro Soavi)。二氢青蒿素对照品和原料(陕西汇生医药科技有限公司，对照品含量高于99%，制剂原料含量98%);国产精制蛋黄卵磷脂(西安力邦制药有限公司，PC含量85%)，大豆油、甘油和维生素E等其他试剂为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。二氢青蒿素脂肪乳(1 g/L)、空白脂肪乳为自制品。

2 方法与结果

2.1 二氢青蒿素脂肪乳制备

取精制大豆油10 g，加入1.2 g精制蛋黄卵磷脂、维生素E 0.2 g和二氢青蒿素 0.1 g，加热搅拌约 10～20min，混匀。另取注射用水 70mL，加入甘油 2.25 g、F68 2.6 g、油酸钠 0.1 g。在氮气保护和搅拌条件下，将油溶液缓慢加入水溶液中，调节总量至100mL。于高压均质机中均质10min，均质压力为850 bar，得到的二氢青蒿素脂肪乳的粒径为150～250 nm，调节pH 6.0～8.5，过滤，分装，通入氮气，密封。121℃灭菌15 min，灯检合格后，包装。合格的乳剂应该是均匀的乳状溶液，没有沉淀、分层和飘油现象。试验用空白脂肪乳即不含药物的脂肪乳按照同样工艺制备，并同在室温保存。

2.2 溶液制备

精密称取二氢青蒿素对照品10.0mg，置10 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解并定溶至刻度，摇匀，0.22μm滤膜过滤，即得1 g/L的对照品溶液。精密量取二氢青蒿素脂肪乳100μL，加无水乙醇溶解并定溶至3mL，摇匀，0.22μm滤膜过滤即得供试品溶液。精密量取空白脂肪乳100μL，加无水乙醇溶解并定溶至3mL，摇匀，0.22μm滤膜过滤，即得阴性对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱:Agilent HC －C18柱(250mm × 4.6mm，5μm);流动相:乙腈 － 水(60∶40，V ∶V);流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;检测波长:216 nm;进样量:20μL。

2.4 方法学考察

干扰试验:取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液分别进样，对照品和供试样品溶液中二氢青蒿素色谱峰保留时间和峰形完全相同，而阴性对照品溶液在此保留时间内无干扰(见图1)。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密称取二氢青蒿素对照品5.5mg，置10mL的棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.55 g/L的二氢青蒿素贮备液。将此贮备液用无水乙醇半数稀释成质量浓度分别为 0.275，0.137 5，0.068 75，0.034 375，0.017 187 5，0.008 59，0.004 29 g/L 的待测溶液，各进样 20 μL，于216 nm波长处测定，以吸收峰面积 A×10－4为纵坐标、二氢青蒿素质量浓度 C(g/L)为横坐标进行回归分析，得标准曲线A=535542C－1533.5，r=0.9997(n=7)，线性范围为 0.002129～2.18 g/L，定量下限为 0.002 129 g/L。

精密度试验:取质量浓度为0.1 g/L的对照品溶液，依法连续重复进样6次。结果二氢青蒿素平均峰面积为452 948，RSD=0.4%(n=6)，表明进样精密度良好。

重复性试验:取同一批号的样品，分别按2.2项下方法制备6份对照品溶液和供试品溶液，分别进样20μL，以外标法分别计算含量。结果二氢青蒿素的 RSD为2.8%，表明方法重现性良好。

稳定性试验:精密量取同一供试品溶液20μL，室温下放置，分别于 0.5，1，2，4，8，24 h 时进样，记录峰面积。结果二氢青蒿素的 RSD为0.23%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:分别精密称取素对照品 15，1.5，0.045mg，置于10mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，从中取1mL，加入100μL空白脂肪乳，混合均匀后按2.2项下方法操作，分别进样20μL并记录峰面积，由回归方程计算回收率。结果见表1。二氢青蒿素、平均回收率为 95.33%，RSD 为 1.40%(n=9)。

2.5 样品含量测定

精密吸取3个不同批次(111025，111026，111027)的样品依2.2项下方法稀释，于216 nm波长处检测，用标准曲线法计算样品含量，每个样品测定3次。结果见表2。

3 讨论

由于二氢青蒿素在210 nm波长处吸收较弱，干扰性强，很难准确测量。二氢青蒿素在216 nm波长处也有较强吸收，且色谱峰分离良好，故选择检测波长为216 nm。同时，由于二氢青蒿素在有机溶液中是以α异构体和β异构体两种构型平衡存在，在溶解初期，主要是β异构体峰，随着放置时间的增加，β异构体峰逐渐减少，α异构体峰逐渐增大，最后达到一对相对平衡状态。因此，在检测二氢青蒿素脂肪乳中二氢青蒿素含量时，将216 nm波长下α异构体峰和β异构体峰峰面积之和记录为峰面积。

查阅有关文献，曾考察了甲醇－水(60∶40)、乙腈－水(55∶45)、乙腈－水(60∶40)等不同比例的流动相系统，当流动相为甲醇－水、乙腈－水(55∶45)时，α峰与β峰较难分离;流动相为乙腈－水(60∶40)时，α峰与β峰得到满意分离，故选择流动相为乙腈 －水(60∶40)。

在检测样品中所含药物的含量时，需要先将脂肪乳破乳，再进行高效液相色谱检测。因为破乳不完全会干扰检测结果，故考察了甲醇、异丙醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等破乳剂的效果:用甲醇破乳时需要用50倍的甲醇稀释二氢青蒿素脂肪乳样品，使得稀释完溶液中药物的含量很低，不利于检测;用异丙醇、DMSO破乳时用30倍稀释后能得到澄清的溶液，但是加入流动相会变浑浊，说明破乳仍不完全;用乙醇破乳时稀释30倍后溶液变澄清，加入流动相时仍然澄清，说明破乳完全，故最终选择乙醇为破乳剂。

本试验将二氢青蒿素包封于脂肪乳中，将脂肪乳注射液作为一种胃肠外能量补给剂和油溶性药物递药载体[13－14]。一方面，可抑制镰状疟原虫、恶性疟原虫的生长，抑制恶性疟原虫生长的半数致死量(IC50)值为8.07 g/L;另一方面还可降低维生素E的水平、增加亚麻酸的含量，从而增强抗疟作用[15－19]。同时，它能为疟疾患者提供营养，改善营养不良患者的淋巴细胞活性，有助于患者抵抗疟疾和康复。本试验中建立了反相高效液相色谱法测定O/W型二氢青蒿素脂肪乳剂中二氢青蒿素的含量，回收率与精密度高，重现性好，可用于二氢青蒿素脂肪乳剂中二氢青蒿素含量的测定。

表1 二氢青蒿素加样回收试验结果(n=9)

表2 样品含量测定结果(标示量的%，n=3)

[1]蔡瑾瑾，祝 琳，晁若冰.TLC检查双氢青蒿素中的有关物质[J].华西药学杂志，2006，21(3):304 － 305.

[2]吴鸿扬.青蒿的药用价值与展望[J].药物与临床，2006，8(2):186.

[3]Efferth T，Olbrich A，Bauer R.mRNA expression profiles for the response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate，arteether and artemether[J].Biochem Phamacol，2002，64(4):623.

[4]Disbrow GL，Baege AC，Kierpiec KA，etal.Dihydroartemisinin is cytotoxic to papillomavims－expressing epithelial cells in vitro and in vivo[J].Cancer Res，2005，65(23):10 861.

[5]Lai H，Sasaki T，Singh NP.Targeted treatment of cancer with artemisinin and artemisinin－tagged iron－carrying compounds[J].E.rpertOpin Ther Tayets，2005，9(5):1 007.

[6]相丽欣.双氢青蒿素研究进展[J].广西轻工业，2010(3):7－8.

[7]马玉樊，卢婷利.二氢青蒿素对人成骨肉瘤MG－63细胞凋亡的诱导作用[J].中国细胞生物学学报，2011，33(12):1 324－1 330.

[8]Franceschinis E，Voinovich D，Grassi M.Self－emulsifying pellets prepared by wet granulation in high－shear mixer:influence of formulation variables and preliminary study on the in vitro absorption[J].International Journalof Pharmaceutics，2005，291(1 － 2):87 － 97.

[9]Abdalla A，Mader K.Preparation and characterization of a self－emulsifying pellet formulation[J].European Journalof Pharmaceuticsand Biopharmaceutics，2007，66(2):220 －226.

[10]Cannon JB.Oral solid dosage forms of lipid－based drug delivery systems[J].Am PharmaceutRev，2005，8:108 － 115.

[11]Tuleu C，Newton M，Rose J.Comparative bioavailability study in dogs ofa self－emulsifying formulation of progesterone presented in a pellet and liquid form compared with an aqueous suspension of progesterone[J].Journalofpharmaceutical sciences，2004，93(6):1 495 － 1 502.

[12]Nazzal S，Khan MA.Controlled release of a self－emulsifying formulation from a tablet dosage form:Stability assessment and optimization of some processing parameters[J].International Journal of Pharmaceutics，2006，315(1－2):110－121.

[13]朱维铭.脂肪乳的进展[J].江苏临床医学杂志，2002，6(2):103.

[14]陈亭苑.静脉脂肪乳剂的应用和进展[J].肠外与肠内营养，1995，2(4):252.

[15]Deharo E，Krugliak M，Baccam D，etal.Antimalarial Properties of Soy－Bean Fat Emulsions.Int.J[J].Parasitology，1995，12(25):1 462.

[16]Levander OA，Ager AL.Malarial parasites and antioxidant nutrients[J].Parasitology，1993，107:106.

[17]Levander OA，Ager AL，Morris VC，etal.Protective effect of ground flaxseed or ethyl linoleate in a vitamin E－deficient diet againstmurine parasite[J].Nutrition Research，1991，11:948.

[18]Kumaratilake LM，Robinson BS，Ferrante A ＆ Poulos A.Antimalarial properties of n－3 and n－6 polyunsaturated fatty acids:In vitro effects on Plasmodium berghei[J].Journal of Clinical Investigations，1992，89:967.

[19]Krugliak M ＆ Ginsburg H.Studies on the antimalarialmode of action of quinoline－containing drugs:time－dependence and irreversibility of drug actionn，and interactions with compounds that alter the function of the parasite’s food vacuole[J].Life Sciences，1991，49:1 219.