间－尼索地平对大鼠急性肺损伤的保护作用＊

杜景霞，张永健

(1.邢台医学高等专科学校，河北 邢台 054000;2.河北医科大学，河北 石家庄 050017)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期阶段，是指由心源性以外各种肺内外致病因素引起的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，是肺部炎症和通透性增加的综合征，严重威胁着人类的健康。肺血管内皮细胞的改变在急性肺损伤中十分重要[1]，肺毛细血管内皮细胞在细菌内毒素(lippopolysaccharide，LPS)、细胞因子、氧自由基等的作用下，其通透性增高，分泌和释放各种炎症介质和细胞因子，如肿瘤坏死因子 α(TNF－α)、白细胞介素1β(IL－1β)、白细胞介素 2(IL－2)、白细胞介素6(IL－6)，以及黏附分子(ICAM －1，ECAM －1，VCAM －1，E －selection)、趋 化 因 子(C3，MCP－1)，使肺血管内皮细胞受损，从而导致ALI。败血症时，细菌内毒素是导致ALI的重要因素之一。LPS是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，向动物血管内注入LPS能引起严重肺内炎症和组织损伤，是ALI体内研究的经典模型之一。本研究中整体观察了LPS对大鼠肺血管通透性的影响，肺泡上皮细胞Ca2+浓度，肺泡灌洗液中蛋白的变化，TNF－α含量变化等，以探讨钙拮抗剂间－尼索地平对脂多糖诱导的ALI是否有保护作用，为ALI治疗提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

低温离心机(英泰TGL16M);超低温冰箱(美国MDF－290AT型);丹吉尔数字医学图像分析系统(山东丹吉尔电子有限公司);电热真空干燥箱(上海福玛实验设备有限公司);Floustar多功能微板分析仪(德国BMG公司)。大肠杆菌脂多糖(美国Sigma公司);丙二醛(MDA)试剂盒，蛋白测定试剂盒，TNF－αELISA试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。

1.2 动物及分组

取60只雄性清洁级SD大鼠，体重250～350 g，随机分成3组，每组各20只。分组包括生理盐水组(A组)、模型组(B组)、间－尼索地平组(C组)。

1.3 动物模型制备及给药方法

A组和B组均用羧甲基纤维素钠灌胃，C组予间－尼索地平2.0mg/kg灌胃，灌胃体积均为每 100 g体重 1.5mL，30min后，B组和C组经尾静脉给予5mg/kg的脂多糖进行造模，A组经尾静脉给予等体积的生理盐水。

1.4 取材及标本制备

制备血清:造模后6 h，分别将对应组别大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg进行麻醉，打开腹腔，从下腔静脉取血，静置30min以上，4℃ 3 000 r/min离心15min，－80℃冻存备用。

支气管－肺泡灌洗液(BALF):开胸腔结扎右肺，暴露气管，行气管插管，用6mL无菌4℃生理盐水分3次行左支气管肺泡灌洗液，回收率超过80%。将BALF以1 000 r/min离心10min，取出上清，上清再以3 000 r/min离心10min，分装，－80℃ 冻存。

病理切片:取右肺中、上叶用于W/D测定，右肺下叶用10%中性福尔马林固定，行病理切片检查。

肺组织匀浆液制备:每组另外选10只大鼠，取出左肺，用滤纸吸干血液和水分后称重，剪碎组织，以1∶9比例加入生理盐水，用细胞破碎仪在冰浴条件下破碎组织10 s，共3次。将制成的混悬液以4℃、3 000 r/min离心15min，吸取上清分装，－80℃保存，待用。

肺泡上皮细胞内Ca2+浓度检测:取出各组右肺，检测Ca2+浓度。

1.5 检测指标与方法

病理学观察:肉眼观察肺组织的病理改变，常规包埋、切片，HE染色，光镜观察肺组织。BALF中TNF－α和蛋白含量测定:取－80℃ 冻存BALF上清液，室温水浴快速化冻，按试剂盒操作说明书分别测定TNF－α和蛋白含量。肺W/D值计算:取右肺上叶，用滤纸沾干水分及血液，称重，然后置真空干燥箱中80℃烘烤24 h，称干重，计算肺W/D值。肺组织中MDA含量、血清蛋白质含量测定:取－80℃ 冻存肺组织匀浆液上清，室温水浴快速化冻，按试剂盒操作说明书分别进行MDA的测定，在全自动生化分析仪测得血清蛋白质含量。肺毛细血管通透指数(CPI)测定:CPI=BALF中蛋白含量/血清蛋白质含量。肺泡上皮细胞内Ca2+浓度检测:将取出的右肺组织细胞沉淀用D－Hanks液制成密度为105～106的细胞悬液(台盼蓝排斥试验，活细胞大于90%)，用流式细胞仪进行荧光检测，测出标本荧光强度 F。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0 forWindows软件包。所有数据均以±s表示，采用 t检验。显著性水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺组织病理变化

B组小鼠肺泡间隔增宽，气道管腔内有大量的中性粒细胞聚集，可见肺组织水肿，点、片状出血;C组肺损伤明显减轻，仍有轻度肺组织水肿、出血。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理变化

2.2 BALF中 TNF－α和 MDA含量

结果见表1。造模后(B组和C组)BALF中TNF－α含量显著升高(P＜0.01)。与 A 组比较，B组BALF中TNF－α，MDA及蛋白质含量均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而C组比 B组则显著下降(P ＜0.05)。

2.3 肺W/D值及CPI

结果见表1。与A组比较，B组大鼠肺W/D值及CPI明显增加(P ＜0.01)，而 C 组比 B 组显著下降(P ＜0.01或 P ＜0.05)。

2.4 肺泡上皮细胞内Ca2+浓度

见图2。

3 讨论

目前认为，脂多糖诱导ALI主要通过多种信号转导途径、基因表达、酶活性及功能蛋白含量调节等方面起作用。脂多糖可以通过与效应细胞膜上的受体系统(包括多个蛋白分子，如CD14，TLR4，CXCR4，HSP70，HSPgO 等)相互作用，结合于单核 － 巨噬细胞、中性粒细胞及内皮细胞[2]，从而启动细胞内信号转导系统基因转录，产生多种趋化因子，引起大量中性粒细胞在肺微血管内聚集，然后与内皮细胞黏附，释放脂质过氧化物、血小板活化因子、花生四烯酸、蛋白酶等介质，造成内皮细胞、肺泡上皮细胞和间质成分受损，以致肺泡毛细血管通透性增加，导致肺水肿[3]。本研究中通过观察脂多糖致伤后6 h肺W/D值、BALF中TNF－α及MDA值、肺毛细血管通透指数、肺泡上皮细胞内Ca2+浓度等指标，成功地复制了急性肺损伤模型。

表1 各组大鼠观察指标比较(± s，n=10)

表1 各组大鼠观察指标比较(± s，n=10)

注:与 A 组比较，□P ＜0.05，■P ＜0.01;与 B 组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别A组B组C组TNF－α(ng/L)262.6 ±63.7 560.40±121.1■430.5 ±102.3■▲MDA(nmol/mg)5.61±0.59 8.69±1.04■6.24±0.86▲蛋白质含量(g/L)0.44 ±0.13 0.96 ±0.24■0.73 ±0.23△CPI 13.27 ±3.2 32.30 ±6.5■19.86 ±7.0□▲W/D 4.23±0.17 4.98±0.30■4.61±0.39△

图2 各组肺泡上皮细胞内Ca2+浓度比较

Ca2+是维持人体生命活动的重要元素，在维持肌肉的收缩性、促进糖原和蛋白的转换以及维持血管平滑肌的张力方面起着很重要的作用，同时，细胞内游离钙离子(Ca2+)在细胞信号转导中起重要的第二信使和信号转导作用。金胜威[4]的研究结果表明，LPS可刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞的钙内流，细胞内游离钙离子浓度的升高是产生活性氧的必要条件[5]，升高的细胞内Ca2+可激活活性氧合成酶和线粒体呼吸链的氧自由基形成[6]。ALI时肺泡上皮细胞内Ca2+浓度明显升高，引起肺泡－毛细血管膜通透性增加，肺血管内与间质间隙之间液体交换障碍，导致液体聚集于肺泡和间质间隙，发生肺水肿[7]。

目前认为，ALI发病过程中也有细胞凋亡的作用。关于细胞凋亡的发生发展，已有研究证明细胞内钙超载是细胞凋亡发生过程中普遍存在的中间介质[8]。

钙拮抗剂可通过阻止钙离子过度内流而防止损伤时细胞Ca2+浓度明显升高，减轻细胞损伤，同时通过阻止脂多糖信号向胞内转导而影响致炎因子及其mRNA的表达，且通过清除氧自由基和抗氧化作用[9]而减轻体内脂质过氧化程度。在脂多糖作用下，L型慢通道钙拮抗剂可通过阻断钙离子内流，减轻细胞内钙离子过载，同时通过活化MAPK和PYK2信号通路引起核转移因子(NF－κB，AP－1)移位，减少细胞凋亡，影响致炎因子及其mRNA的表达而起到肺保护作用[10]。

本研究中，间－尼索地平(2.0 mg/kg)对肺泡上皮细胞内Ca2+浓度影响与肺损伤减轻程度呈正相关，同时可见BALF中MDA及TNF－α含量、肺CPI及W/D值显著降低，组织病理学检查亦发现肺组织损伤程度有所减轻，说明该药对脂多糖诱导的急性肺损伤有一定的保护作用。

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