HS-GC-MS法分析比较十二种西藏红景天样品的挥发性成分*

谢惜媚，陈 彬，刘 岚，彭 俊，徐爱国，蒋思萍，陆慧宁

(1.中山大学测试中心，广东广州 510275;2.西藏自治区高原生物研究所，西藏自治区拉萨 850001;3.中山大学化学与化学工程学院，广东广州 510275)

红景天 (Rhodiola)是景天科红景天属多年生草本植物，在西藏有32种，具有海拔分布特性，可生长在3 000～5 600 m的灌丛、石缝及乱石滩等环境中。该属植物的大多数种的根茎可入药，其中大花红景天 (Rhodiola crenulata)、柴胡红景天(Rhodiola bupleuroides)和长鞭红景天 (Rhodiola fastigiata)等为藏医用药的主要种属，均有抗缺氧、抗疲劳的功效，还有治疗心血管疾病和肺结核的功效［1］。临床上红景天已开始用于预防高原反应、延缓衰老，治疗冠心病、心绞痛、心律失常、抗肿瘤及化疗的辅助用药［2］，崔艳梅等［3］对红景天属植物化学成分及药理作用研究进展作了较系统的综述，红景天活性成分主要为红景天苷、红景天素及红景天多糖等。Yang等［4］从大花红景天根醇溶性部分分离鉴定了37个化合物，其中包含在红景天中新发现的11个木质素及1个苯丙腈化合物，37个化合物对α－葡萄糖苷酶均具有强烈的抑制活性。对西藏红景天挥发油化学成分研究的相关报道主要都采用水蒸汽蒸馏提取、气质联用分析法，含量较高的挥发性成分有香叶醇、正辛醇和芳樟醇等［5－7］，Lei等［8］采用 GC-MS 分析比较了西藏大花红景天与云南大花红景天的挥发油成分，Wang等［9］采用HS-GC-TMS法分析了高山红景天与圣地红景天的挥发性化合物。Ljuba等［10］采用GC-MS分析比较了保加利亚、中国和印度的三个蔷薇红景天样品的挥发油成分。保加利亚红景天主要成分是香叶醇其次是桃金娘烯醇;中国红景天主要成分是香叶醇，其次是正辛醇;印度红景天主要成分是苯乙醇，其次是桃金娘烯醇和正辛醇。

目前开发应用最为成熟的是大花红景天，已有多种药品和功能性饮品。青藏高原独特气候造成大多数植物生长缓慢，某些红景天种属的大量采掘导致这些品种逐渐面临濒危的境地，寻找其他替代品种成为了迫切的工作。本文采集到了西藏不同地区红景天的5个种属12个样品，采用HS-GC-MS的方法对所采集的红景天样品进行挥发性化学成分及相对含量进行分析，比较了它们成分上的异同以及总离子流图的相似度。结合指纹图谱分析，该方法还可以为红景天药材种属和产地鉴别提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器及条件

美国Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum XLS串联四级杆气－质联用仪，带TriPlus RSH三合一自动进样器 (采用自动顶空进样功能)。色谱柱TG－5SILMS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，载气He，流量1 mL/min;进样针保温100℃，进样口温度250℃，进样量 1 mL，分流进样，分流比20∶1;柱起始温度50℃，保持3min，以5℃/min升至100℃，然后以10℃/min升至200℃，再以20℃/min升至250℃保持1 min;电离方式EI;接口温度250℃，离子源温度250℃;电离能70 eV;倍增器电压800 V;采用Q3MS全扫描模式，扫描质量范围29～500 amu。标准谱库为美国NIST 11谱库。

1.2 样品采集、鉴定与处理

样品采自西藏拉萨、山南、林芝和那曲等地区9县。样品经西藏高原生物研究所李晖研究员鉴定，6个为大花红景天，2个为小丛红景天 (Rhodiola dumulosa)，2个为长鞭红景天，1个为喜马红景天，1个为柴胡红景天 (见表1)。样品切片、阴干，用粉碎机粉碎，过50目筛，玻璃瓶储存备用。

表1 红景天样品Table 1 The Rhodiola amples

1.3 实验条件的选择

1.3.1 取样量的选择 分别称取样品 (准确至1 mg)0.50、1.00、1.50 g于20 mL顶空瓶中，100℃恒温30 min，间歇自动震荡10 s，停止10 s。各取1.0 mL顶空气体进样实验，结果显示取样量1.00 g的总离子流图各峰形强度及对称性为最佳。

1.3.2 平衡时间及平衡温度的选择 各取样品1.00 g(准确至1 mg)分别进行平衡温度80、100、120℃平衡时间10、20、30、40 min的正交实验，得出平衡时间30 min、平衡温度100℃为最佳实验条件。

1.3.3 参照物及加入量的选择 首先考虑所选参照物是所测样品中不含该成分，且该化合物与所测挥发性成分性质接近，同时能够基线分离。初步实验结果显示，所有检测的红景天样品中均不含薄荷脑成分，因此选择了薄荷脑作为参照物。各取1.00 g(准确至1 mg)样品分别加入浓度为12.58 mg/mL的薄荷脑/甲醇溶液3.0、5.0、10.0 μL在上述条件下进行实验，结果显示在此范围内薄荷脑的加入量与峰面积之间线性关系良好，R2=0.998。选择1.00 g样品加入3.0 μL上述参照物溶液进行测试，能使参照物峰强度落在样品中各挥发性成分峰的强度之间。

1.3.4 样品测试条件 取红景天样品约1.00 g置20 mL顶空瓶中，加入浓度为12.58 mg/mL的薄荷脑/甲醇溶液3.0 μL，在100℃震荡加热30 min，进样针100℃预热，抽取1.0 mL上层气体，按“1.2.1 仪器及条件”进样。

1.4 重复性实验

取同一种大花红景天样品1.00 g(准确至1 mg)6份，每份加入浓度为12.58 mg/mL的薄荷脑/甲醇溶液5.0 μL，分别进行测试分析，计算该样品中检测到的21个挥发性成分与参照物的相对峰面积，结果见表2。

表2 大花红景天样品的重复性实验结果Table 2 Relative peak areas of different volatile components

从表2结果可以看出，同一样品进行6个平行样测试，21个挥发性成分与参照物的相对峰面积的RSD＜8.5%(n=6)，由此可见本方法用于红景天样品中微量的挥发性成分测定是可行的。

2 样品测试与结果讨论

2.1 样品测试

按照取样品1.00 g(准确至1 mg)于20 mL顶空瓶中，加入浓度为12.58 mg/mL的薄荷脑/甲醇溶液3.0 μL，100℃平衡30 min，抽取上层气体1.0 mL顶空进样的测试条件，分别对12种红景天样品进行测试，每个样品各进行2次平行试验，各种红景天典型的总离子流图见图1;12种样品共检出30个组分 (表3中序号为27的成分是内标物)，检索结果见表3;计算样品中各组分与参照物薄荷脑的相对峰面积，2次平行测试结果取平均值见表4;用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版)计算各样品与6号样品谱图的相似度见表5。

图1 12种红景天挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile composition from twelve Rhodiolas

2.2 结果讨论

2.2.1 成分定性和相对量比较 表3列出了12个样品所含共30个挥发性成分的定性鉴定结果。大花红景天含其中的25个成分，含量较高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮和伞花烃等。据文献报道，用水蒸汽蒸馏法提取的西藏大花红景天主要挥发性成分为香叶醇、正辛醇和芳樟醇等。本实验采用直接顶空法测定的大花红景天主要成分为正辛醇及芳樟醇，与文献报道基本一致。由于顶空平衡温度相对较低，高沸点的香叶醇测定结果比水蒸汽蒸馏法偏低。长鞭红景天含其中24个成分，含量较高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮、伞花烃和香叶醇等，与大花红景天比较接近，不同的是该品种含有反式－松香芹醇。小从红景天含有13个挥发性成分，含量较高的成分是正辛醇和甲基庚烯酮，还含有大花红景天所没有的苯乙醇。喜马红景天含有其中12个成分，含量较高的成分是苯乙醇 (相对峰面积0.35，占该样品挥发性成分相对含量31.4%)，大花红景天及长鞭红景天均不含有该成分。柴胡红景天仅含6个挥发性成分，主要挥发性成分则是β－蒎烯 (相对峰面积1.39，占该样品挥发性成分相对含量75.4%)。

表3 红景天挥发性成分检索结果Table 3 Chemical components of volatile composition from Rhodiolas

表4 红景天挥发性成分相对含量 (以与内标物的相对峰面积表示)Table 4 Relative contents of volatile composition from Rhodiolas(represent by the relative peak area with internal standard)

在表4中，用添加的参照物薄荷脑 (保留时间15.09 min)的峰面积校准各成分在不同样品中的相对含量，使表4的数据间具备可比性。

统计表4数据，样品1至12的挥发物总量(相对峰面积总和)依次为:10.9，6.1，6.5，6.8，5.9， 12.6，3.4， 10.3，1.5， 2.0， 1.1、1.8。可以看出，样品9、10、11、12的总挥发物含量与其他样品相比偏少。

以上定性和定量结果表明，长鞭红景天挥发性成分及含量与大花红景天较接近，而小丛红景天、喜马红景天和柴胡红景天与大花红景天相比差异较大。

2.2.2 TIC谱图的相似度比较 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以峰较多的6号大花红景天样品为参照，对其它11种红景天样品的TIC图进行比较分析，结果列于表5。由表5可见:采自不同地区的大花红景天样品相似度较高，基本都在0.9以上 (其中2号样品的相似度偏低，样品中氧化芳樟醇含量比芳樟醇高，这可能与样品处理过和保存过程的偶然因素有关，原因有待考证)。样品7、8是同地区不同季节采集的两个长鞭红景天样品，它们与6号大花红景天谱图相似度分别是0.831和0.870，在所分析的5个红景天品种中，长鞭红景天与大花红景天的相似度最高。将两个长鞭红景天进行对比，相似度为0.856，显示由于采集季节不同，挥发性成分存在一定差异。样品9、10是不同季节采自不同地区的小丛红景天，与6号大花红景天谱图相似度分别是0.623和0.655，差异比较大，同样对两个小丛红景天样品的TIC谱图比较，相似度为0.710，显示由于采集季节和地区不同，样品间差异较大。样品11是喜马红景天，样品12是柴胡红景天。它们与6号大花红景天相比，其相似度分别为0.483和0.433，存在很大差异。

表5 各样品与6号样品TIC谱图的相似度Table 5 The TIC similarity between 6 and other samples

以上分析得到初步结论:红景天的TIC谱图相似度与品种、采样季节和产地相关。其中相同品种、相同采样季节、不同产地间差异较小 (如5个大花红景天间相似度在0.9以上)。品种间差异较大 (5个种属相似度在0.8～0.4之间);同品种、同产地不同采样季节也存在一定差异 (如7、8的相似度约为0.85);同品种、不同产地不同采样季节的差异进一步扩大 (如9、10间的相似度约为0.7，基本符合产地和季节两个因素的叠加)。由此得到结论:相似度受品种、采样季节和产地三个因素的影响程度依次降低。

成分定性和相对量分析结果与色谱指纹图谱相似度评价结果相当一致。前者从化学结构的角度解析每个挥发性成分，作为基础研究是必不可少的。后者从统计学的角度评价样品之间的相似程度更为系统和科学。两者相结合，更有利于对不同种属、采集季节和产地的红景天进行全面地鉴别和评估。

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