48个油橄榄品种的遗传多样性及聚类分析

陈海云 陈少瑜 宁德鲁 李瑞 李勇杰 毛云玲 吴涛

油橄榄（Olea euyopaea L.）为木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea Linn.）植物，原产于小亚细亚和叙利亚及其东部邻近地区，后扩展到希腊，是地中海地区重要的亚热带常绿果树和木本油料树种。油橄榄品种繁多，据统计，世界各地油橄榄自产品种共计1275个，中国现有登记品种共158个［1］。我国于1964年开始油橄榄的引种，之后开展了大量的栽培和品种选育等方面的研究［2］，但由于引种的渠道较多、管理不够完善，加上长期的人工选育，使得品种同名异物、同物异名的现象较为严重，给生产和科研带来很多不便，采用分子标记技术进行油橄榄品种鉴定、分类和遗传多样性研究，探讨品种间的亲缘关系，对油橄榄品种资源的规范管理以及进一步遗传育种有重要意义。

近年来，国外已有一些采用RAPD，AFLP，SSR和ISSR等分子标记技术进行油橄榄品种鉴定和遗传多样性研究的报道［3-7］，而国内这方面的研究还非常缺乏。仅见邱源等［8］采用RAPD技术对23个引种的油橄榄品种进行分类和鉴定研究，以及马万里等［9］运用RAPD技术进行了澳大利亚油橄榄品种的鉴定研究。鉴于此，本研究拟采用成本低、稳定高、操作简单、重复性强的ISSR分子标记技术对云南省永仁县油橄榄品种资源收集圃中的48个油橄榄引种和选育品种进行遗传多样性和聚类分析，为这些油橄榄品种资源的规范管理、进一步的开发利用和良种选育提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

分析材料来源于收集种植在云南省楚雄州永仁县油橄榄品种资源收集圃的48个油橄榄品种（表1），其中包括35个引种品种（1-35），13个国内选育品种（36-48）。以嫩叶为提取基因组DNA的材料。采集嫩叶后放入装有硅胶的自封袋中，带回实验室置-20℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及质量检测 采用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen）提取48个油橄榄品种的基因组DNA，0.8 ％琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，具体方法见文献［10］。

1.2.2 ISSR-PCR扩增 扩增体系：总体积20μL中含1×Taq Buffer，3.5mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 µmol/L 引物，1.0U Taq DNA聚合酶，20 ng DNA模板；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-55℃退火30s，72℃延伸2min，40循环；72℃延伸10min，4℃保存。用筛选出的清晰稳定、多态性强的11条引物（北京奥科鼎盛生物技术有限公司合成）对48个品种样品进行扩增。各引物的序列、退火温度见表2。扩增产物于2.0％的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳电压为4 V/cm，电泳结束后在凝胶紫外成像仪上观察、拍照。

1.2.3 数据统计与遗传分析 根据DNA Marker判读电泳图谱中扩增条带的分子量大小及有无，同一位点有条带的记为“1”，无条带的记为“0”。采用Excel软件对胶板样本条带进行转化，构建0/1数据矩阵。以Excel软件的数据记录为基础，利用DCFA1.1软件将ISSR谱带统计结果转换为POPGENE软件适用文件，根据POPGENE计算得到的Nei’s遗传距离和遗传相似性系数，基于各样本的遗传距离或遗传相似性系数数据，运用NTSYSpc 2.10软件进行所有样本的UPGMA聚类。

2 结果

2.1 ISSR-PCR扩增结果

用筛选出的11条ISSR引物对48个样品进行扩增，图1为引物826和引物866对部分样品的扩增图谱；扩增的统计结果列于表2。由表2可见，11条引物一共扩增出106条DNA谱带，平均每条引物扩增9.63条带。各条引物扩增的条带数3-16条不等，其中引物UBC-826扩增的条带数最多（16条），引物UBC852的最少，仅有3条。扩增的条带分布在300-2 600bp之间，主要分布区间为500-1500bp。由扩增图谱（图1）可以直观看到，所有样品有相同的扩增位点，也有范围较广的特异扩增位点，一定程度上说明所分析的油橄榄品种间的同源性，以及其遗传背景的复杂性和多样性。

2.2 遗传多样性状况

图1 引物826（A）和866（B）对部分油橄榄样品的ISSR扩增图谱

由表2可见，106个扩增位点中有99个为多态性位点，总的多态位点百分率为93.40％。其中UBC-814、UBC-816、UBC-826和UBC-874等 4条引物扩增产物的多态位点百分率皆为100％，引物UBC-852扩增的位点数最少，多态百分率也最低，仅有66.67％。可见，云南永仁县油橄榄品种资源收集圃中收集的油橄榄品种资源具备了较高的遗传多样性和丰富的遗传基础。

表1 48个油橄榄品种原产地、来源及主要用途

表2 用以ISSR扩增的11条引物序列、退火温度及对59个品种的扩增结果

2.3UPGMA聚类结果

根据POPGENE计算得到各品种的Nei’s遗传距离和遗传相似性系数，运用NTSYSpc 2.10软件进行所有品种的UPGMA聚类（图2）。图中以遗传距离0.171处作一结合线，可以将所有48个品种分成4个大类：第Ⅰ类有6个品种，除来源于达州的奥托卡和米扎两个引种品种外，其他4个品种皆为昆明本地选育的品种，包括3个杂交品种和1个亲本，这一类又可分为2个亚类Ⅰ-ⅰ和Ⅰ-ⅱ，每个亚类各包含了3个品种。第Ⅱ大类包含有主要来源于希腊和武都的13个引种品种以及大部分国内选育品种（7个）的共20个品种，其中国内选育的7个品种全部归并于Ⅱ-ⅰ亚类中，直接引种于希腊的柯基、柯基优、贝翠丽-p和贝翠丽-t全部聚在了Ⅱ-ⅱ亚类中。第Ⅲ类仅包含皮瓜尔、格罗桑、皮削利和沃丽4个品种。第Ⅳ大类共有18个品种，其中16个为引种品种，主要来源于希腊和广元，只有2个品种（城固31和城固32）为国内选育的品种。这一大类在0.150出被分成了4个亚类，Ⅳ-ⅰ仅有莫约拉1个品种；Ⅳ-ⅱ包含切拉姆、城固32、城固31、卡林和爱桑5个品种，国内选育的2个品种在此亚类中；Ⅳ-ⅲ亚类包含有12个品种，全部都是引种品种，直接引种于希腊的7个品种全部归类于其中。

3 讨论

本研究用筛选出的11条ISSR引物对48个样品进行扩增，在全部106个扩增位点中有99个为多态性位点，总的多态位点百分率为93.40％，数据表明油橄榄品种间的多态性比较高。这可能是广泛的种质起源以及漫长的进化和长期的人工选育的结果［11］，这一结果从分子水平上初步证明了油橄榄种质广泛和复杂的遗传背景。另一方面也揭示了云南永仁县油橄榄品种资源收集圃中收集的油橄榄品种资源具备丰富的遗传基础，这些资源为进一步油橄榄种质的开发和利用提供了物质基础。

图2 48个油橄榄品种的UPGMA聚类

根据各品种的Nei’s遗传距离（或遗传相似性系数），进行所有品种的UPGMA聚类，结果48个油橄榄品种被聚成了4个大类，其中第Ⅰ大类包含2个亚类，第Ⅱ大类包含2个亚类，第Ⅲ大类仅有1个亚类，第Ⅳ大类包含3个亚类。对各大类及亚类的品种进一步分析，国内选育品种基本聚类于2个类群中，其中3个杂交品种及其亲本位于第Ⅰ大类（占30.8％），7个品种（占53.8％）聚类于Ⅱ-ⅰ亚类中，这2个类群中国内选育品种占到了总数的84.6％，只有15.4％的国内选育品种（2个）列于Ⅳ-ⅱ亚类中；另外，从聚类结果看，大多数引种品种并没有按照地理起源（原产地）而更多是依据引种材料来源地和主要用途来聚类的，例如第Ⅱ大类中的品种主要来源于武都和希腊，而第Ⅳ大类的品种材料主要来源于希腊和广元；著名的果用品种超克、贝拉聚于Ⅳ-ⅲ亚类中，卢克斯和阿斯聚于Ⅱ-ⅰ亚类中。可见，在漫长的人类利用油橄榄种质资源的过程中，由于广泛、复杂的引种和选育，造成以生长、经济性状和抗性等为主要目标的选择和引种压力和油橄榄种质间频繁的基因交流，进而导致本研究的聚类结果。这一结果与Claros等［12］、Besnard等［13］、Rotondi 等［14］和 Hagidinitrious 等［4］的研究结果相似，他们分别对希腊和意大利主栽品种进行了RAPD、AFLP、SSR及聚类分析，结果表明由于不同地域间频繁的品种交换，导致划分的类群与其地理起源没有明显的关系，而与果实的大小和用途明显相关。在油橄榄的杂交育种实践工作中可以借鉴本项研究的聚类结果，即选择亲缘关系较远的育种材料为亲本，以选育出更为优势、更符合当地发展的油橄榄优良品种。

4 结论

本研究采用ISSR分子标记技术对云南省永仁县油橄榄品种资源收集圃中收集的48个油橄榄品种资源进行了遗传多样性和UPGMA聚类分析，研究结果表明，所收集的油橄榄品种具有丰富的遗传多样性（多态位点百分率达93.40％），基于遗传距离的UPGMA聚类表明大多数引种品种并没有按照地理起源（原产地），而主要是根据引种材料来源地和主要用途进行聚类的。

［1］吴开志, 肖千文, 贾瑞芬, 等. 油橄榄品种表型性状的多样性［J］. 经济林研究, 2008, 26（2）：48-52.

［2］姜成英, 戚登臣, 苏瑾. 甘肃省油橄榄生产现状与发展对策［J］.经济林研究, 2006, 24（2）：78-81.

［3］Belaj A, Satovic Z, Ralh L, et al. Optimal use of RAPD markers for identifying varieties in olive（Olea europaea L.）germplasm collections［J］. J Amer Soc Hort Sci, 2004, 129（2）：266-270.

［4］Hagidinitriou M, Katsiotis A, Menexes G, et al. Genetic diversity of major Greek Olive cultivars using molecular（AFLP and RAPDs）markers and morphorlogical traits［J］. J Amer Soc Hort Sci, 2005,130（2）：211-217.

［5］Owen CA, Bita EC. Banilas G, et al. AFLP revealed structural detail of genetic diversity within cultivated olive germplasm from the Eastern Mediterranean［J］. Theor Appl Genet, 2005, 110：1169-1176.

［6］Montemurro C, Sineone R, Pasqualone A, et al. Genetic relationships and cultivar identification among112 olive accessions using AFLP and SSR markers［J］. Hort Sciences, 2005, 80（1）：105-110.

［7］Bemard R, Manzo M, Durante M, et al. Molecular markers for cultivar characterization in Olea europaea［J］. Acta Horticulturae, 2002,586：97-100.

［8］邱源, 韩华柏, 李俊强. 23个油橄榄品种的RAPD分析［J］.林业科学, 2008, 44（1）：85-59.

［9］马万里, Collins G. 运用RAPD技术鉴定澳大利亚油橄榄品种的研究［J］. 内蒙古师范大学学报：自然科学汉文版, 2006, 35（3）：337-339.

［10］李瑞, 陈少瑜, 宁德鲁, 等. 油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选［J］. 安徽农业科学, 2012（10）：5797-5799.

［11］Martins-Lopes P, Lima-Brito J, Gomes S, et al. RAPD and ISSR molecular markers in Olea europaea L.：Genetic variability and molecular cultivar identification［J］. Genetic Resources and Crop Evolution, 2007, 54：117-128.

［12］Claros GM, Crespillo R, Aguilar ML. et al. DNA fingerprinting and classification of geographically related genotypes of olive tree（Olea europaea L.）［J］. Euphytica, 2000, 116：131-142.

［13］Besnard G, Breton C, Baradat P, et al. Cultivar identification in olive based on RAPD markers［J］. J Amer Soc Hort Sci, 2002, 126：668-675.

［14］Rotondi A, Magli M, Ricciolini C, et al. Morphological and molecular analyses for the characterization if a group of Italy olive cultivars［J］. Euphytica, 2003, 132：129-137.