抗生素耐药性大肠杆菌外膜蛋白mOmpA N端序列分析

赵志平 聂鑫 李再新 丁杰 张智 谢万如

近年来，抗生素耐药大肠杆菌的种类和数量越来越多，并且具有抵抗多种抗生素的能力，如红霉素、喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素［1，2］。大肠杆菌的抗生素耐药机制非常复杂，主要包括阻碍细胞壁和核酸合成、抑制蛋白质合成、破坏细胞膜结构等［3，4］。大肠杆菌外膜蛋白能保护细胞免受或减少多种有害物质的影响，如抗生素、蛋白酶和毒素等［5］。大肠杆菌外膜蛋白主要包括OmpA、OmpC和OmpF等，在影响抗生素等有害物质的通透性方面发挥着至关重要的作用。其中，OmpA是研究的最为透彻的大肠杆菌外膜蛋白［6］。

1998年，Pautsch 和 Schulz［7］最早通过 X-射线衍射技术确定了大肠杆菌OmpA的结构，并将研究结论发表在Nature Structural Biology杂志上。2001年，Arora等［8］利用核磁共振NMR技术研究了大肠杆菌OmpA的结构，相关研究成果也发表在Nature Structural Biology杂志上。研究发现，大肠杆菌OmpA外膜蛋白含有325个氨基酸残基，包括N端和C端两个区域。其中，N端区域包含171个氨基酸残基，包含8个以β-折叠形势存在的跨膜片段［9］。C端包含129个氨基酸残基，含有较多的α-螺旋。N端和C端通过富含Ala-Pro铰链序列相连［10］。

OmpA最早在大肠杆菌K12中被发现，随后得到广泛、深入的研究。OmpA属于高丰度蛋白，每个细胞中含有约105个拷贝［11］。OmpA对外膜的结构整合和外膜蛋白的装配、结构起着决定性作用［12］。OmpA可以作为抗菌素和细菌噬菌体受体、免疫靶点，并且和大肠杆菌的吸附和侵入密切相关［13］，在大肠杆菌接合转移和生物膜形成过程中都发挥着重要作用［14］。OmpA N端区域对于OmpA的装配、结构功能发挥着重要的作用。目前，尚无有关于OmpA N端序列突变的研究报道。

本研究从抗生素耐药大肠肝菌中克隆mOmpA基因并构建表达载体pET32a-mOmpA，旨在为进一步了解大肠杆菌OmpA的结构功能及大肠杆菌耐药机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 抗生素（氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素）耐药大肠杆菌、DH5α和pET-32a载体为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和限制性内切酶 Hind III、EcoR I限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR试剂等购自大连宝生物公司。DL2000 plus Marker为美科美（北京）公司产品，高保真Pfu DNA聚合酶购自Promega公司，质粒DNA抽提试剂盒和DNA过柱快速纯化试剂盒购自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 抗生素耐药性大肠杆菌的分离 收集经病理学鉴定为大肠杆菌致死的兔子，无菌解剖，从肠道、肝脏及心脏中采集疑似菌染液，做倍比稀释。将稀释液均匀涂布在LB培养基平板上，37℃倒置培养，观察细菌的形态特征。挑取生长良好的单个菌落，依次接种于伊红美蓝培养基平板和麦康凯培养基平板上，37℃倒置培养，观察单个菌落的颜色、形态。最后挑取符合大肠杆菌形态特征的单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养14-16h后，涂片、染色、镜检，确认为纯培养物。

1.2.2 引物设计 根据GenBank报道的大肠杆菌OmpA基因序列（ID：7437746）设计mOmpA引物。mOmpA-F引物序列为：5'-GAATTCATGAAAAAGACAGCTATCGCG-3'（下划线为EcoR I限制性酶切位点）。mOmpA-R引物序列为：5'-AAGCTTAGCCTGCGGCTGAGTTACAAC-3'（下划线为Hind III限制性内切酶位点）。

1.2.3 煮沸法提取革兰氏阴性细菌基因组DNA 将分离的抗生素耐药大肠杆菌菌株剧烈振荡过夜培养，取1mL菌液，离心弃上清；用1mL灭菌超纯水漂洗2次，离心弃上清。用100μL灭菌超纯水重悬，沸水煮6min，冰上放置5min。离心后将上清移入一干净的1.5mL EP管中，即为总DNA，-20℃保存备用。

1.2.4 mOmpA的克隆 利用引物mOmpA-F和mOmpA-R从提取的基因组DNA中扩增mOmpA。PCR反应体系为：10×Pfu buffer 5μL，10μmol/L mOmpA-F引物 2μL，10μmol/L mOmpA-R引物 2μL，dNTP（各10mmol/L）1μL，基因组 DNA 10 ng-1μg，加灭菌超纯水至50μL。PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 70s，30个循环。mOmpA大小为1100bp。

1.2.5 表达载体pET32a-mOmpA的构建 EcoR I和Hind III酶切mOmpA片段5h，利用过柱纯化试剂盒回收；pET-32a经EcoR I和Hind III酶切后用同样方法纯化。取3.5μL双酶切的mOmpA片段与1.5μL双酶切的pET-32a于16℃连接过夜。连接产物加入到100μL DH5α感受态细胞中，冰水放置30min后42℃热激90s，冰水放置2min。加入600μL LB培养基后于37℃孵育1h，取100μL培养液涂布在LB固体培养基（Amp 50μg/mL）上，37℃培养14-16h后进行菌落PCR验证，PCR引物为mOmpA-F和T7 terminator。取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒经EcoR I和Hind III酶切验证后寄送深圳华大基因测序。

1.2.6 mOmpA N端序列分析 利用DNAMAN软件对测序序列进行比对分析，利用Swiss-Model网站预测分析OmpA N端蛋白质结构。

图1 mOmpA基因片段的PCR扩增

2 结果

2.1 mOmpA的克隆

利用高保真Pfu DNA聚合酶从提取的抗生素耐药大肠杆菌基因组DNA中扩增了mOmpA片段，凝胶电泳得到了1100bp左右的明亮条带（图1），初步判断PCR扩增正确。

2.2 表达载体pET32a-mOmpA的构建

EcoR I-Hind III双酶切的mOmpA片段和pET-32a连接转化后经PCR验证获得阳性克隆，如图2所示。从图2可以看出，以菌落2和4为模板扩增得到了1100bp左右的明亮条带，100bp处条带为引物二聚体。为进一步验证表达载体的正确性，经培养后提取其质粒DNA，EcoR I和Hind III酶切后得到1100bp左右的目标片段，如图3所示。

图2 表达载体的菌落PCR验证

图3 表达载体的酶切验证

2.3 mOmpA N端DNA序列比对分析

菌落PCR和EcoR I-Hind III酶切验证正确的重组质粒DNA经深圳华大基因测序。将其N端序列与OmpA N端序列进行了比对分析，结果（图4）显示，mOmpA与OmpA N端的同源性为79.93％，发生了较大程度的突变。mOmpA N端长度是542bp，而OmpA N端长度为512bp，并且有两处发生明显突变，分别增加了15bp。

2.4 mOmpA N端氨基酸序列比对分析

mOmpA N端DNA序列翻译成氨基酸序列后与OmpA N端序列进行了比对分析，结果如图5所示。mOmpA与OmpA N端长度分别为181和171个氨基酸残基，同源性为81.17％，有较多的氨基酸残基发生了突变。OmpA N端含有8个β-折叠区域，mOmpA此区域有7个部位的氨基酸残基发生了突变。其中，β1-折叠区域的Thr30和Ala32分别被Ala30和Gly32所取代。β3-折叠区域的Vla70、β4-折叠区域的Tyr93、β5-折叠区域的Thr127分别被Leu70、Phe93和Ser127所取代。β6-折叠区域的Asn135和Tyr150分别被Glu135和Trp150所取代。OmpA N端 含 有 4个 loop（L）环，mOmpA的L1和L3处发生了明显变化，分别增加5个氨基酸残基，它们分别是L1处的Gly43、Phe44、Tyr45、Gly46和 Asn47；L3处的 Tyr126、Asn127、Ser128、Thr129和Gly130。OmpA N端含有3个转角（Turn），T1和T2没有发生突变。T3发生3处突变，Ile152、Pro154和Glu155分别被Val152、Arg154和Asp155所取代。mOmpA N端氨基酸序列，尤其是β-折叠、Loop环和T转角等重要区域氨基酸的突变对其空间结构可能产生一定的影响。

2.5 mOmpA N端空间结构预测

鉴于mOmpA的Loop环和转角等重要区域发生突变，为预测其空间结构是否发生变化，使用了Swiss-Model在线工具对其进行了蛋白质空间结构预测，结果如图6所示。从图6可以看出mOmpA的L1、L2、L3和L4环的方向较OmpA都发生了明显的变化。这些变化可能与Loop环部分氨基酸残基发生突变有着密切关系。

3 讨论

图4 mOmpA和OmpA N端核苷酸序列比对分析

图5 OmpA和mOmpA N端氨基酸序列比对分析

图6 mOmpA和OmpA N端蛋白结构预测

OmpA是研究膜蛋白结构的模式蛋白，其N端区域的8个β-折叠区在其组装过程中发挥着重要的作用［7，11］。mOmpA的 5个 β-折叠区发生了不同程度的突变，但蛋白质空间结构预测显示β-折叠区的突变并未明显改变其空间构型。mOmpA的T3转角处发生了3处突变，这3处突变可能与mOmpA的Loop环的方向发生了显著变化有关。OmpA在大肠杆菌抵御抗生素等有毒物质过程中发挥着重要的作用［5］，对其抵御胁迫条件同样具有重要的作用［15］。OmpA N端氨基酸的突变是否会影响其功能以及其形成的膜孔通道还有待进一步试验验证。OmpA在致病性大肠杆菌进化和抗生素耐药过程中发挥着重要作用。OmpA是普遍存在于革兰氏阴性菌表面的蛋白，在细菌生命活动中发挥着至关重要的作用，它可以作为细菌的黏附素和侵袭素，参与生物膜的形成，也可作为多种噬菌体的受体，是先天免疫系统的重要靶位。因此，外膜蛋白的易突变性加大了致病性大肠杆菌的防治，增加了外膜蛋白疫苗的研制难度。

4 结论

本研究克隆了mOmpA，序列分析表明mOmpA N端DNA和氨基酸序列均发生了显著突变。Swiss-Model分析显示，mOmpA的N端空间结构发生了一定的变化，尤其是Loop环的方向发生了显著变化。

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