小菜蛾颗粒体病毒PP31蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

王思民 张鸿杰 黎路林

小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulosis virus，PlxyGV）属于杆状病毒科、β-杆状病毒属，是一类特异性感染小菜蛾的病毒。其宿主小菜蛾（Plutella xylostella）属于鳞翅目菜蛾科，对十字花科植物具有较大的危害，严重影响甘蓝、花椰菜、白菜、油菜、芥菜及萝卜等十字花科蔬菜的生产。PlxyGV对小菜蛾有高度致病性，其制剂已被应用于小菜蛾的防治，具有杀虫持续时间长、无生物安全隐患、不易产生抗药性等优点。

PlxyGV基因组为单一双链环状DNA，大小约为101 kb，G+C含量为41％，预测有120个开放阅读框（Open reading frame，ORF）。其中有74个基因与杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus AcMNPV）基因具有同源性，pp31基因是其中的一个［1］。pp31基因存在于已完成测序的所有鳞翅目杆状病毒基因组中。AcMNPV pp31基因的编码产物是一种磷酸化的DNA结合蛋白，可以非特异性地与DNA结合［2，3］。AcMNPV PP31蛋白具有至少 4个磷酸化位点，其中3个已经确定，其磷酸化由宿主激酶和病毒编码（或诱导）的激酶催化［4］，但目前尚不清楚哪种宿主激酶作用于PP31。在受感染细胞中，AcMNPV PP31定位于病毒发生基质，占核蛋白总量的5％［3］。在瞬时表达试验中，如果不包含pp31基因，晚期报告基因的表达水平会下降90％-98％［5，6］，因此将其归类于杆状病毒晚期表达因子。然而，最新的研究显示，从AcMNPV基因组中敲除pp31基因后，缺失pp31基因的AcMNPV突变体在Sf9细胞中仍然能够进行复制，但病毒滴度降低；pp31基因的缺失导致99个病毒基因转录水平下降［7］。关于PP31蛋白在病毒复制过程中的功能还不清楚。

PlxyGV pp31的预期编码产物是一个由252个氨基酸残基组成的多肽，与AcMNPV PP31的序列相同度仅13％［1］。本实验室之前的研究发现，PlxyGV PP31蛋白可以与宿主细胞的细胞激酶C受体（RACK）以及甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）发生相互作用［8］。本研究对PlxyGV PP31蛋白进行原核表达，制备PlxyGV PP31多克隆抗体，以期为进一步研究PlxyGV PP31的分子生物学特征和功能属性之用。

1 材料与方法

1.1 材料

pET28a 载 体 以 及 E.coli菌 株 BL21（DE3）、DH5α均为本实验室保存。限制性内切酶均购自Fermentas公司，T4连接酶为TaKaRa公司产品，蛋白纯化使用的ProBondTMResin购买自Invitrogen公司。多克隆抗体制备所使用的新西兰大白兔由中国科学院武汉病毒所提供。

1.2 方法

1.2.1 PlxyGV pp31基因的克隆 根据PlxyGV全基因组序列设计pp31基因（36120-36878 nt）引物进行PCR扩增。上游引物：5'-CTGCCATGGATACTGCCGAAAGCGT-3'； 下 游 引 物：5'-AGCGGTCGACATCAGATTTTATTAAATCGC -3'。下划线标注的为限制性内切酶酶切位点，上下游引物分别为NcoⅠ和SalⅠ。上游引物中，pp31基因第二个密码子第一个碱基由“T”改为“G”。为了使pp31基因3'端融合的6×His标签序列可以表达，设计下游引物时去掉了基因的终止密码“TAA”。使用上述引物，以PlxyGV DNA为模板进行PCR扩增，所得产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并进行回收纯化。

1.2.2 重组表达质粒的构建 用NcoⅠ和SalⅠ双酶切回收的pp31基因片段以及pET28a载体；回收酶切后产物，用T4连接酶在16℃水浴连接过夜；将连接产物转化至DH5α菌株并筛选阳性克隆，获取重组表达质粒pET28a-pp31。

1.2.3 融合蛋白诱导表达 将重组表达质粒pET28app31转化至BL21（DE3）菌株中，挑取单菌落至3mL LB中，37℃、250r/min摇菌过夜；取200 µL过夜摇菌菌液至20mL LB中，37℃、250r/min摇菌至OD600到达到0.6；菌液于冰上放置15min后，加入100mg/mL的IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃、250r/min诱导表达；分别在诱导3h以及8h时取1mL菌液；8000r/min离心5min集菌；去上清，用50 µLddH2O悬浮菌体，加相应蛋白上样缓冲液，沸水中煮10min；12000r/min离心10min；取上清进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 融合蛋白的大量表达及纯化 挑取一个含有pET28a-pp31重组表达质粒的BL21（DE3）单菌落于10mL LB培养基中，37℃、250r/min摇菌过夜；取3mL过夜摇菌菌液至200mL LB培养基中，37℃、250r/min摇菌至OD600到达到0.6；取出菌液，冰上静置15min；加IPTG（100mg/mL）至终浓度为 1mmol/L，37℃、250r/min诱导 3h；将菌液富集至50mL离心管中，使用Invitrogen公司ProBondTM树脂进行非变性纯化。

用20mL预冷的裂解缓冲液（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；10mmol/L咪唑）重悬菌体，加入200 µL 100mmol/L的PMSF后，高压破碎菌体；10000×g、4℃离心10min；上清转移至干净的50mL离心管中，加入200 µL ProBondTM树脂，水平摇床上冰浴轻摇孵育1h；将孵育好的溶液过重力柱，收集少量流出液，记为FT；用预冷的漂洗缓冲液Ⅰ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；20mmol/L咪唑）洗柱，收集开始和最后的少量流出液，分别记为W1和W2；用预冷的漂洗缓冲液Ⅱ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；40mmol/L咪唑）洗柱，收集少量流出液，记为W3；用预冷的漂洗缓冲液 Ⅲ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；60mmol/L咪唑）洗柱，收集最后的少量流出液，记为W4；用1mL预冷的洗脱缓冲液（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；250mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白，记为E1；再取0.5mL预冷的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，记为E2；各取15 µL样品，加入相应蛋白上样缓冲液后，电泳进行SDS-PAGE电泳。

1.2.5 多克隆抗体制备 试验所用的免疫动物为新西兰大白兔。取400-600 µg纯化的PP31蛋白，与等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化后，在新西兰大白兔颈部、背部、四肢等部位皮下多点注射进行第一次免疫。两周后，以等体积弗氏不完全佐剂与PP31蛋白液的混合液注射新西兰大白兔进行第2次免疫。第2次免疫两周后以同样的方法进行第3次免疫。第3次免疫两周后，颈动脉插管收集血液并分离血清，分装后 -80℃保存［9，10］。

1.2.6 Western blot检测抗血清特异性 取纯化的PP31蛋白进行SDS-PAGE电泳；电泳完毕后，凝胶中的蛋白在湿转缓冲液（20mmol/L Tris，190mmol/L 甘氨酸，20％（V/V）甲醇）中转移至PVDF膜上；将转好的膜浸入封闭液（含5％（M/V）脱脂奶粉的TBST（10mmol/L Tris；150mmol/L NaCl；0.05％Tween））中，室温轻摇封闭1h；以制备的抗血清为一抗，用封闭液按1∶15 000稀释，室温轻摇孵育2h；弃一抗溶液，TBST洗膜4次，每次室温轻摇孵育10min；以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用封闭液按1∶2 500稀释，室温轻摇孵育1h；弃二抗溶液，TBST洗膜4次，每次室温轻摇孵育10min；DAB显色试剂盒显色。

2 结果

2.1 PlxyGV pp31基因的克隆及重组表达载体的构建

以PlxyGV全基因组为模板扩增PlxyGV pp31基因，得到一条约750bp条带（图1），与预期大小吻合。得到的产物经过纯化后，经过NcoⅠ和SalⅠ双酶切，连接到表达载体pET28a上，构建成pET28a-pp31重组表达质粒（图2-A）。pET28a-pp31中，pp31基因序列3'端与一段亮氨酸-谷氨酸-6组氨酸编码序列融合。构建的重组质粒分别使用XbaⅠ单酶切以及NcoⅠ、SalⅠ双酶切鉴定（图2-B），XbaⅠ单酶切应切下约670bp条带，NcoⅠ、SalⅠ双酶切应切下约750bp条带。如图2-C所示，酶切鉴定结果与预期一致。测序结果也显示，PlxyGV pp31基因成功插入到了表达载体pET28a上。

图1 PlxyGV pp31基因PCR产物电泳分析

图2 重组表达质粒pET28a-pp31结构图（A）及其酶切验证结果（B）

2.2 PP31-His融合蛋白的诱导表达及纯化

将构建的pET28a-pp31重组表达质粒转化至E.coli BL21（DE3）表达菌株中，用终浓度为1mmol/L的IPTG于37℃诱导PP31-His融合蛋白表达，分别在诱导3h、8h取菌液检测融合蛋白表达情况。如图3所示，相对于未诱导样品，在诱导3h和8h都得到一条29kD左右的蛋白条带，说明重组的pp31基因在1mmol/L IPTG诱导3h即获得了高效的表达。

图3 PP31-His融合蛋白的表达分析

基于上述结果，使用终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃诱导E.coli BL21（DE3）表达菌株中PP31-His融合蛋白表达3h。使用Invitrogen公司ProBondTMResin对带有6×His标签的融合蛋白进行纯化。如图5所示，在破碎细菌后的上清及沉淀中都存在PP31-His融合蛋白，而且在上清中的目的蛋白量明显大于沉淀中的量。经过BondTMResin亲和层析纯化得到的主要是约29kD的蛋白条带，与his-PP31的预期大小相符；另外还有少量微弱的蛋白带，可能是一些没有被洗掉的杂蛋白。

图4 PP31-His的表达、纯化

2.3 Western blot检测抗血清特异性

用纯化的PP31-His融合蛋白分3次免疫新西兰大白兔，第3次免疫两周后，颈动脉插管收集血液并分离血清。将纯化的PP31-His融合蛋白转至PVDF膜上，以得到的血清为一抗进行Western blot分析，抗体用封闭液按1∶15 000稀释，结果见图5，泳道中可以清楚地看到一条较亮且单一的显色条带。说明制备的抗体具有较高的特异，其效价达到1∶15 000以上。

图5 PP31多克隆抗体的Western blot分析

3 讨论

pp31基因存在于所有已完成测序的鳞翅目杆状病毒基因组。AcMNPV pp31编码一种磷酸化DNA结合蛋白。该蛋白存在于病毒发生基质，可与DNA非特异性结合［2，3］。在 AcMNPV感染的 Sf细胞中，PP31蛋白高达核蛋白总量的5％［3］。瞬时表达和基因敲除试验结果显示pp31与AcMNPV基因表达调节有关［5-7］。这些研究结果显示PP31 是一种重要的功能蛋白。对于颗粒体病毒PP31的研究目前鲜见报道。在前期研究工作中，我们发现PlxyGV PP31蛋白与宿主细胞的细胞激酶C受体（RACK）以及甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）发生相互作用［8］。为了进一步开展对PlxyGV PP31的研究，本研究对PlxyGV PP31蛋白进行了原核表达，并制备了多克隆抗体。该抗体可以用于PlxyGV PP31检测和定位。

利用原核表达蛋白免疫动物获得特异性抗体是一种有效、方便的方法。本研究中，以PlxyGV全基因组为模板，通过PCR扩增了PlxyGV pp31基因。将该基因片段连接到pET28a载体上。 pET28a在多克隆位点上下游各有一段表达6×His标签的序列。在克隆过程中去掉了多克隆位点上游的标签序列，仅保留了下游的6×His标签序列，即在目的基因3'端融合了一段6×His标签序列，方便后期蛋白质的纯化。pET系统是一种高效的原核表达系统，在IPTG诱导下，T7 RNA聚合酶被激活，启动目的基因大量表达；而不存在IPTG时，目的基因处于沉默状态，不会进行转录、翻译。在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3h后，目的蛋白就有了高效的表达，并且大部分为可溶性状态。为了获得高纯度、高浓度的目的蛋白，使用镍柱纯化体系对带有6×His标签的融合蛋白进行纯化。在纯化过程中，开始仅使用了含有20mmol/L咪唑的漂洗液进行漂洗，发现最后得到的蛋白液中含有较多的杂蛋白，加大漂洗液用量仍然没有改善。经过多次试验，使用分别含有20、40、60mmol/L咪唑的3种漂洗缓冲液进行漂洗，大大减少了最终获得的蛋白液中的杂蛋白。取纯化得到的目的蛋白液分3次免疫新西兰蛋白兔，每次免疫间隔两周。在免疫注射前，将蛋白液与佐剂混合，以增强抗原免疫原性。最终获得了多克隆抗血清。Western blot试验显示，该血清具有将强的特异性，效价达到1∶15 000。

4 结论

将PlxyGV pp31基因克隆至原核表达载体pET28a在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中表达产生分子量为29kD的含组氨酸标签的融合蛋白。用该融合蛋白制备的PlxyGV PP31特异性兔抗血清兼具高效价和特异性，可以应用于PlxyGV的检测和基础研究工作。

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