正交设计优化广西火桐ISSR-PCR反应体系

代文娟 骆文华 马虎生 符支宏，2 唐文秀 赵博 盘波 黄仕训

广西火桐（Erythropsis kwangsiensis）为梧桐科、火桐属（Erythropsis）植物，中国特有种，仅分布于广西中部至南部的石灰岩地区，对研究植物区系和植物地理及亲缘关系等均有重要的学术价值。野生资源量极少，具有重要的经济价值和科研价值，为国家二级重点保护植物［1］。

简单序列重复区间（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是一种基于SSR的简单重复序列区间扩增多态性分子标记［2］，它结合了SSR和RAPD的优点，主要特点是操作简单，遗传多态性高，重复性好，耗资少，模板DNA用量少。因此，ISSR标记技术广泛应用于植物遗传多样性的研究［3-6］。

目前，尚未见利用ISSR对广西火桐进行遗传分析的报道。为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，对ISSR-PCR反应体系进行优化非常必要。本试验利用正交设计对广西火桐ISSR-PCR反应中的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度进行系统的研究，并探讨退火温度和反应循环次数对ISSR-PCR的影响，以期建立稳定且重复性好的广西火桐ISSR-PCR反应体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 广西火桐材料取自广西植物研究所内10 株成年植株的当年生嫩叶。

1.1.2 试 剂 Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶等均购于上海生物工程有限公司，ISSR引物由上海生物工程有限公司合成；经初步筛选将引物U835［（Ag）8YC］作为此次正交试验的引物。

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取 利用植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司）进行DNA的提取，操作步骤参照说明。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计与PCR扩增采用 L16（44）正交试验设计，对 MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行4因素4水平筛选，方案如表1所示。表中共有16个处理，每个处理做2个重复，共32管，按表中的数据加样。在Biometra TProfessional PCR仪（华粤企业集团有限公司）上进行扩增。反应体系为25μL，除表中所列因素外，每管还有1× PCR buffer。根据文献资料［7，8］，初步确定 ISSR-PCR 扩增程序为 ：94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃最后延伸7min。扩增后的PCR产物在4℃保存。

表1 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计［L16（44）］

1.2.3 温度梯度PCR 在PCR梯度扩增仪上设置最小退火温度为45℃，最大为60℃，PCR仪自动形成8个梯度，即45℃、45.9℃、48℃、50.8℃、54.5℃、57.5℃、59.1℃、60℃每个梯度设3次重复。PCR反应体系根据正交试验的结果而定，扩增程序除退火温度外，其余同1.2.2。

1.2.4 循环次数的确定 设置25、30、35、40、45这5个不同循环次数，PCR反应体系和扩增程序中的退火温度分别根据正交试验和温度梯度PCR试验结果而定，其余同1.2.2。

1.2.5 ISSR-PCR产物的检测 扩增反应结束后，10μL上样液含1μL GelGreen核酸染料在1％琼脂糖凝胶中电泳60min，电压设定为120V，于生物电泳图像分析系统（美国UVP）成像分析系统拍照记录。

2 结果

2.1 正交设计的结果

2.1.1 各因素对PCR反应影响的差异 L16（44）正交设计的试验和PCR扩增结果，见图1。根据电泳条带数、亮度和背景对每个处理进行评分，并将结果计入表1中。图1显示第9、14和15组条带明亮、背景清晰、数量较多。其余组合或没有条带，或条带较暗、数量少，或背景模糊。因此，第9、14、15组的评分较高，第1、2、4组的评分较低。对重复处理的PCR电泳结果评分2计入表1，其结果与第1次PCR扩增结果高度一致。对16个处理评分结果进行极差分析，各因素对反应体系的影响从大到小依次为MgCl2、模板DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs（表2）；各个因素的最佳反应水平分别为：MgCl2为第4个水平，dNTPs为第3个水平，Taq DNA聚合酶为第3个水平，模板DNA为第2个水平。最佳组合为MgCl2为2.5mmol/L，dNTPs为0.2mmol/L，Taq DNA 聚合酶为 0.06U/μL，模板 DNA为3ng/μL。但这一组合在正交表中并没有出现，与分值较高的两个组合（第14组和第15组）较接近。

图1 ISSR-PCR正交试验结果

表2 ISSR-PCR正交试验结果极差分析

为了弥补极差分析的缺陷，用DPS 9.50统计软件对结果进行了方差分析。结果（表3）显示，各因素对广西火桐ISSR-PCR反应的影响程度从大到小依次为：MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTPs。其中，模板DNA浓度、dNTPs对结果的影响未达到显著水平；Taq DNA聚合酶对结果的影响都达到了显著水平，MgCl2对结果的影响都达到了极显著水平，所以还应对MgCl2和Taq DNA聚合酶进行水平间的多重比较。

表3 ISSR-PCR正交试验结果方差分析

2.1.2 各因素不同水平间多重比较 随着MgCl2浓度从1.0-2.5mmol/L增加，扩增结果均值由小变大，当增加到2.5mmol/L时均值最大（图2），且与其他3个水平之间差异均达到极显著水平。因此，MgCl2最佳浓度为2.5mmol/L。

图2MgCl2浓度与评分结果均值的关系

dNTPs浓度从0.1-0.25mmol/L（图3），扩增结果均值没有规律变化，在0.20mmol/L时均值最大，且与其他3 个水平之间的差异达到极显著水平。

TaqDNA聚合酶浓度从0.02-0.08U/μL，扩增结果均值先增大后减小，在0.06U/μL时均值最高，0.02U/μL时均值最低（图4），且与其他3个水平之间的差异均达到极显著水平。

随着DNA模板浓度增大（图5），扩增结果均值无规律变化，当浓度为2ng/μL时均值最低，为3ng/μL时均值最高，且与其他3个水平之间差异达到极显著水平。

2.2 退火温度的确定

图6中，各个退火温度均能扩增出产物，且背景清晰。但若退火温度过低，特异性差，有些主带不明显，见图6中的泳道1（45℃）、泳道2（45.9℃）、泳道3（48℃）；退火温度过高，引物与模板的特异性增强，造成多态性偏低，扩增产物较少或谱带亮度相对较弱，如图6 中的泳道6（57.5℃）、泳道7（59.1℃）、泳道8（60℃）；合适的退火温度，即泳道4（50.8℃）和泳道5（54.5℃）扩增产物多态性高，条带清晰明亮，背景清晰。故本试验以52℃为ISSR-PCR扩增的最佳退火温度。

图3 dNTPs浓度与评分结果均值的关系

图4 Taq DNA聚合酶浓度与评分结果均值的关系

图5 DNA模板浓度与评分结果均值的关系

2.3 循环次数的确定

根据正交试验结果所得的最佳反应体系，在最适退火温度下，对PCR循环数进行梯度试验，设置5 个梯度，结果如图7所示。当循环次数为30时能得到清晰稳定且丰富的条带，而其他循环次数的扩增产物有所减少，背景模糊，有些条带较弱甚难辨读。因此，30个循环是该反应体系的最佳循环次数。

图6 温度梯度PCR电泳图（UBC857）

图7 循环次数试验

2.4 ISSR-PCR反应体系稳定性

用UBC835引物对10份广西火桐DNA用优化后ISSR-PCR体系及扩增程序进行扩增，结果显示（图8），扩增谱带明亮，背景清晰，稳定性好，多态性丰富，表明该反应体系和反应程序稳定性、重复性较好，适合于广西火桐进行ISSR-PCR反应。

图8 引物U835在10份广西火桐样品中的ISSR扩增结果

3 讨论

影响ISSR反应体系的因素包括MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度等。研究表明，MgCl2浓度对PCR反应影响较大，不仅影响Taq DNA聚合酶的活性，也影响 PCR 产物的解链温度、产物的特异性、模板与引物的结合等［9］。过量的MgCl2会导致酶催化非特异性产物的扩增，而浓度过低，又使酶的催化活性降低。本试验中，MgCl2浓度为2.5mmol/L时扩增效果最佳。dNTPs作为PCR反应的原料，浓度太低会使扩增反应不完全，从而降低PCR产物的产量；浓度过高会对MgCl2产生抑制作用，影响Taq DNA酶活力，造成浪费［10］。试验结果显示，dNTPs浓度为0.2mmol/L时，扩增得到的条带数量和质量均较理想。Taq DNA聚合酶浓度过高或过低都会影响扩增的结果。本试验中，0.06U/μL的Taq DNA聚合酶浓度最佳。PCR反应对模板DNA用量要求的范围通常较广，在60-100ng内均可获得较好的扩增效果［11，12］。但为避免DNA中杂质对试验的影响，应尽可能采用较低的模板浓度进行扩增。因此，本试验中的DNA用量为3ng/μL。综合以上分析和经济因素，选择第14组合作为广西火桐ISSR-PCR反应的最佳体系。

引物的理论退火温度（Tm值）和通过试验选出的最适退火温度并无明显规律性［13，14］，试验结果支持这一观点。本试验中选用引物U835的理论退火温度为56℃， 但试验结果显示52℃是最佳退火温度。

循环次数决定产量，循环次数偏少，产物扩增不完全，条带不明亮；循环次数偏多，错配几率增加，非特异性产物增多，条带易弥散。此外，循环次数还受各反应成分的用量限制。通过试验，广西火桐ISSR-PCR反应的最佳循环次数为30。

4 结论

广西火桐的ISSR-PCR反应体系最佳扩增反应条 件 为 ：25μL 体 系 中 1×PCR buffer，2.5mmol/L MgCl2，0.15mmol/L dNTPs，0.06U/μL Taq DNA 聚合酶，3ng/μL DNA模板，0.2μmol/L引物。适合广西火桐的最佳扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性 45s，52℃退火45s，72℃延伸 1.5min，共30个循环；72℃最后延伸7min。

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