三种潜在饲料益生菌耐受性及拮抗病原菌研究

孙红梅 王腾飞 李丕武 唐卫华 曲丽娜 王瑞明

随着世界上许多国家限制或禁止对抗生素的使用，抗生素作为饲料添加剂的时代即将过去，益生菌是最先被提出的替代品［1］。益生菌（Probiotic）是通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主（人和动物）健康水平和健康佳态的活菌制剂及其代谢产物［2］。布拉德酵母菌主要有强化肠黏膜组织和释放B 族维生素等营养物质，提高动物的营养素的吸收和利用，减少营养性腹泻，提高生长速度，调节机体局部免疫功能来抵抗病毒的侵袭等功能［3］。乳酸菌，特别是乳杆菌，是定植在人和动物胃肠道的微生物类群中最多、最重要的一种，主要有拮抗病原微生物，调节动物消化道微生物区系平衡，活化免疫系统，增强免疫力等功能［4，5］。芽孢杆菌具有抑制其它外来病原微生物在胃肠道内的定植或增殖的作用，并且具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性［6］。仔猪因肠道内尚未建立稳定的微生态系统，易受各种病原微生物的侵袭导致仔猪腹泻，仔猪腹泻容易引起仔猪死亡，严重降低了养猪生产者经济效益，益生菌在预防和治疗仔猪腹泻中以其安全、无副作用、效果好的特点受到越来越多的青睐。若要使益生菌充分发挥其有益作用，必须保证其在肠道内的存活率，通过耐酸、耐胆盐试验及拮抗病原菌试验研究，验证3种潜在益生菌的耐受性及对病原菌的拮抗作用，为3种潜在益生菌在饲料生产实践中的推广和应用提供诸多理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种 布拉德酵母菌（Saccharomyces boulardii），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），以上菌株均为山东省微生物工程重点实验室保藏。

1.1.2 试验用培养基 MRS培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，MgSO4·7H2O 0.058％，MnSO4·H2O 0.025％，吐温80 1mL/L，乙酸钠0.5％，pH6.8。

沙氏培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，pH5.5。

LB培养基：蛋白胨1％，NaCl 1％，酵母粉0.5％，pH7.5。

高浓度盐水营养肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.03％，NaCl 7.5％，pH7.2。

伊红美兰培养基：蛋白胨1％，乳糖1％，磷酸氢二钾0.2％，2％伊红溶液2％，0.5％美兰溶液2％。

上述培养基均121℃、20min灭菌。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备 将斜面上的地衣芽孢杆菌接种于无菌LB培养基中，37℃培养8-12h备用；将穿刺培养的乳酸菌分别接种于无菌MRS培养基中，37℃静置培养18-24h备用；将斜面上的布拉德酵母菌接种于无菌沙氏培养基中，30℃培养24-30h备用；将斜面上的大肠杆菌接种于无菌LB培养基中，37℃培养8-12h备用；将斜面上的金黄色葡萄球菌接种于无菌LB培养基中，37℃培养12-24h备用。

1.2.2 耐酸性试验 配置pH值1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的无菌生理盐水，取上述制备好的布拉德酵母菌液1mL，在pH值1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的无菌生理盐水中稀释100倍。将稀释液放入恒温培养箱中静置1、2、3和4h。到时间取出的稀释液用无菌的生理盐水进行十进制的梯度稀释，利用平板菌落计数法计数。试验重复3次。地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的测定方法同上。

1.2.3 耐胆盐浓度试验 配置胆盐浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％（W/V）的无菌生理盐水，取上述制备好的布拉德酵母菌液1mL，在胆盐浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％（W/V）的无菌生理盐水中稀释100倍。将稀释液放入恒温培养箱中静置培养0、1、2、3和4h。到时间取出的稀释液用无菌的生理盐水进行十进制的梯度稀释，利用平板菌落计数法计数。试验重复3次。地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的测定方法同上。

1.2.4 拮抗病原菌试验 各取制备好的3种益生菌和金黄色葡萄球菌菌液1mL在4℃，5000r/min离心条件下离心10min，菌体用无菌的生理盐水冲洗，然后将3种益生菌菌体分别与两种病原菌混合悬浮在无菌的生理盐水中。37℃静置培养4h，取样，用平板菌落计数法活菌计数。菌落计数培养基用无菌高浓度盐水营养肉汤培养基。试验重复3次。拮抗大肠杆菌测定方法同上。菌落计数培养基用无菌伊红美兰培养基。

1.2.5 试验数据处理 将3次平行试验所得数据取平均值。

2 结果

2.1 耐酸性试验结果

布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌在处理前的存活数（log CFU/mL）分别为8.10、8.60和9.49，图1-图3显示，当pH为4.0和5.0时，布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数在培养至4h均没有明显下降；当pH为3.0时，植物乳杆菌的存活数没有明显下降，布拉德酵母菌菌株稀释液经过2h培养后，存活数为处理前的57.4％，随着时间的推移，菌株数量明显下降。地衣芽孢杆菌菌株稀释液经过3h培养后，存活数为处理前的64％，随着时间的推移，菌株数量明显下降，但仍有一定的菌株存活；当pH值为1.0和2.0时，3种潜在益生菌菌株稀释液经过1、2、3和4h培养后，菌株数量有明显下降，但仍有一定量的菌株存活。

图1 布拉德酵母菌在不同pH生理盐水中培养的存活数

图2 地衣芽孢杆菌不同pH生理盐水中培养的存活数

图3 植物乳杆菌不同pH生理盐水中培养的存活数

2.2 耐胆盐浓度试验结果

由图4-图6可见，当猪胆盐浓度分别为0.05％和0.1％（W/V）时，布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数没有明显下降；当胆盐浓度为0.2％和0.3％（W/V）时，地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数与猪胆盐浓度为0％相比，存活数没有明显下降，布拉德酵母菌的存活数有一定的下降，但仍有一定数量的存活数。

图4 布拉德酵母菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培养的存活数

图5 地衣芽孢杆菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培养的存活数

图6 植物乳杆菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培养的存活数

2.3 拮抗病原菌试验结果

由图7和图8可见，布拉德酵母菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，其中布拉德酵母菌对大肠杆菌的抑制率达到75.9％，对金黄色葡萄球菌的抑制率达到61.3％；地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，抑制率达到72.3％，对大肠杆菌的抑制作用较弱，抑制率仅为56.4％；植物乳酸菌对大肠杆菌的抑制作用较强，抑制率达到63.1％，对金黄色葡萄球菌的抑制率仅为41.8％。

3 讨论

饲料益生菌饲喂断奶仔猪，若想发挥其益生作用，必须经受断奶仔猪胃内的酸性环境和消化系统中一定的胆盐浓度，才能在肠道内存活并发挥其有益作用［7］。由于断奶仔猪体内胃肠道消化环境中，胃酸的 pH 值约为3.0-6.0，食物通过胃的时间相对较短，一般为1h左右，且存在一定浓度的胆盐，猪消化道中胆盐含量约为0.03％-0.3％，因此有些益生菌进入消化道后，不能有效地抵抗胃酸、胆盐的作用，无法到达肠道或定植肠道而发挥有益作用［8］，成为目前饲用益生菌仍存在的问题，针对这些问题，研究工作者应进一步选育生产性能高、耐受性强的菌种。

图7 三种潜在益生菌对大肠杆菌的抑制率

图8 三种潜在益生菌对金黄色葡萄球菌的抑制率

本试验体外模拟仔猪消化道酸性和胆盐环境，研究的3种潜在益生菌对酸及胆盐均具有较好的耐受性。布拉德酵母菌由于其特殊的外壁结构而对酸性和胆盐环境都有较好的耐受性。植物乳杆菌为以乳酸为唯一或主要代谢产物的细菌，故对酸性环境十分适应，当pH为3.0时，植物乳杆菌的存活数都没有明显下降。地衣芽孢杆菌是兼性厌氧菌，它在一定条件下能产生抗逆性内生孢子，是具有应用潜力的菌种之一，本研究与Cenci［9］和董尚智等［10］的研究都发现，地衣芽孢杆菌具有良好的耐酸性。地衣芽孢杆菌属于耐胆盐菌株，这与董尚智的结果基本一致，主要是芽孢杆菌的芽孢衣可维持芽孢膜的表面张力，使芽孢杆菌对胆盐表现出较强的耐受性。

断奶仔猪腹泻疾病史饲养过程中常见病，其中病原微生物的侵袭导致的腹泻给养猪业造成了较高的经济损失，可引起仔猪腹泻的病原微生物主要有大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等。试验选用两种病原微生物即大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初步验证3种潜在饲料益生菌对两种病原菌均有一定的拮抗作用，其中布拉德酵母菌可抑制病原微生物的繁殖，对大肠杆菌的抑制率达到75.9％。目前，芽孢杆菌的抑菌作用主要认为是在生长代谢过程中能产生蛋白多肽类抗菌物质和大量的溶菌酶，直接抑制病原菌的生长繁殖，地衣芽孢杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制率达到72.3％，此次研究与王美秀［11］和来航线［12］的结果基本一致。乳酸菌的抑菌作用主要认为是能够分解糖类产生乳酸，降低环境pH值，产生细菌素抑制或杀死病原菌，植物乳杆菌对大肠杆菌的抑制率达到63.1％。本次研究为3种菌株作为益生菌提供了一定的理论依据。

初步验证试验用3种潜在益生菌可以耐受仔猪消化道内的酸性环境及胆盐浓度，并且有可能通过拮抗病原菌的作用对仔猪产生益生作用，为3种菌株作为仔猪饲料益生菌提供了部分试验依据和潜力。

4 结论

当pH为3.0时，植物乳杆菌经过4h培养后存活数没有明显下降；当pH为4.0和5.0时，布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数经4h培养，均没有明显下降。当胆盐浓度为0.2％和0.3％（W/V）时，地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数没有明显下降。布拉德酵母菌对大肠杆菌的抑制率达到75.9％，地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制率达到72.3％，植物乳杆菌对大肠杆菌的抑制率达到63.1％。

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