香蕉枯萎病拮抗放线菌1-g-59的筛选与鉴定

刘小玉 周登博 谭昕 高祝芬 陈波 黄霄 张锡炎

香蕉枯萎病又称黄叶病、巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporiumf. sp. cubense）侵染香蕉植株引起的一种毁灭性土传维管束病害，近年来在中国香蕉主产区持续爆发，严重制约着我国香蕉产业的发展［1-3］。其病原菌有4个生理小种［4］，其中4号生理小种（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，FOC4）侵染范围最广，几乎危害所有的香蕉品种，我国香蕉品种多为巴西蕉，受FOC 4威胁最大，因此防治香蕉枯萎病迫在眉睫。据报道，目前对该病防治的主要途径包括轮作、选用抗病品种［5］、化学防治［6］及生物防治等。目前推广的抗病品种属中抗品种，并不能完全控制枯萎病的发生，且农艺性状不佳，品质较差，如台湾1号、GCTCV-215等；使用化学药剂，不仅会杀灭土壤中的有益菌类，且长期使用，对环境污染影响较大。因此生物防治被认为是目前最安全的防治措施，符合环境保护和有机食品发展要求。

香蕉枯萎病的生物防治已成为各国的研究热点。紫黑链霉菌（Streptomyces violaceusniger）［7］、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）［8］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［9］被证明对FOC 4具有明显的抑制作用，Perez-Vicente等［10］研究报道，抗病品种种植与生防菌的施用相结合，对香蕉枯萎病的防效达95％以上，说明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。本研究是采集香蕉植株根际土壤，分离并筛选出对FOC 4有明显抑制作用的拮抗菌株，测定各拮抗菌株的发酵液对FOC 4菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，筛选一株活性最强的拮抗菌株，旨在通过盆栽试验研究其对香蕉枯萎病的防治效果，并通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析和16S rDNA 序列及其系统发育分析等研究对该菌株进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌 香蕉枯萎病病原菌（FOC 4）：尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，FOC4），由本实验室保藏。

供试香蕉苗：巴西蕉，由中国热带农业科学院种苗组培中心提供。

1.1.2 样品采集 供分离的土样采自海南临高美台、南宝蕉园，去除大颗粒石块和植物残渣，备用。

1.1.3 主要培养基 分离放线菌采用高氏一号合成培养基，为抑制细菌与真菌的生长，倒平板前加入0.005％的无菌重铬酸钾。

FOC 4的培养及平板对峙试验采用PDA培养基。

拮抗菌的发酵采用黄豆粉液体培养基（可溶性淀粉20g，酵母粉5g，氯化钠4g，黄豆粉15g，蛋白胨2g，碳酸钙4g，pH7.2-7.4，1×105Pa灭菌50min）。

放线菌的形态学观察采用高氏一号琼脂、酵母膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、无机盐淀粉琼脂、葡萄糖天冬素琼脂、胨酵母膏铁琼脂、酪氨酸琼脂等7种培养基。

1.2 方法

1.2.1 放线菌的分离与筛选

1.2.1.1 土壤放线菌的分离 称取土样10g，加入90mL无菌水，于28℃、200r/min的摇床中充分震荡30min，取其上清液用无菌水10倍逐级稀释，依次稀释成10-2、10-3和10-4浓度，各吸取100μL涂布于加重铬酸钾的高氏一号培养基平板上，于28℃恒温培养箱中倒置培养，适时挑取不同形态的菌落进行划线，纯化后保存。

1.2.1.2 拮抗放线菌的筛选 采用平板对峙法，在无菌环境下，将培养5-6d的FOC 4（直径为6mm）靶标菌接种至PDA平板中央，并在距离靶标菌边缘2.5cm 处接种待测放线菌，以不接放线菌，只接FOC 4的PDA平板作为对照（CK），于28℃恒温培养箱中倒置培养5d后，测量各抑菌带的大小，初筛出对FOC 4有明显拮抗效果的菌株，连续接种5代进行复筛，最终筛选出拮抗效果最好的菌株进行下一步试验。

1.2.1.3 拮抗放线菌发酵液对FOC 4抑制作用的测定 拮抗菌发酵滤液的制备：拮抗菌接种于黄豆粉液体培养基中，28℃、200r/min的摇床中振荡培养7d，取发酵液8000r/min离心15min，上清液用微孔滤膜过滤除菌。

FOC 4孢子悬浮液的制备：将FOC 4接种于PDA固体培养基上，28℃恒温培养箱中倒置培养，待菌丝铺满平板后，用无菌水配制成1×106cfu/mL孢子悬浮液。

拮抗放线菌发酵液对FOC 4菌丝生长的影响［11］：在熔融态的PDA培养基中加入拮抗菌发酵滤液，摇匀制成平板。将直径为6mm的FOC 4靶标菌接种至平板中央，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d后，观察FOC 4菌丝的生长情况，并用显微镜观察各处理的FOC 4菌丝形态变化，以纯培养的FOC 4菌落边缘菌丝为对照，每处理重复3次。

拮抗放线菌发酵液对FOC 4孢子萌发的影响：将拮抗菌发酵滤液与FOC 4孢子悬浮液等体积混合均匀并置于玻片上，于温度为28℃，湿度为80％的人工气候箱中光照培养24h，每一处理设5个重复。取出玻片在显微镜下观察孢子的萌发情况（以孢子萌发的芽管长度达到或超过孢子直径长度的一半定为萌发）［12］，并计算各处理的孢子萌发率，以无菌水处理为对照（CK），以5次重复的平均值作为测定结果。

孢子萌发抑制率（％）=［（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率］×100％

1.2.2 拮抗放线菌1-g-59对香蕉枯萎病的盆栽效果测定 试验设3个处理：①处理1，清水；②处理2，接种病原菌+拮抗放线菌1-g-59发酵液；③处理3，接种病原菌。每处理15株香蕉苗，重复3次。

拮抗菌发酵液与病原菌孢子悬浮液的制备方法同1.2.1.3。

采用蘸根浸菌法接种［13］：用针刺伤香蕉组培苗的根尖，再将根浸没于1×106cfu/mL的孢子悬浮液中，30min后移栽于盆钵中，并将剩余的病原菌孢子悬浮液浇入栽有香蕉幼苗的土壤中，接种后置于室温、自然光照条件下培养，常规的水肥管理。接种病原菌10d后，处理2施用拮抗菌发酵液，每株灌注100mL。

病情分级：0级为无症状；1级为整株无变黄叶片；2级为1-2片叶萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片萎蔫；5级为全株3/4以上叶片萎蔫或死亡。

DSI=∑（病害的级别×该级别的植株数）/供试植株数

相对防治效果（％）=［（对照病情指数－ 处理病情指数）/对照病情指数］×100％

1.2.3 拮抗菌株的鉴定

1.2.3.1 形态特征 采用平皿插片法［14］，将菌株1-g-59接种于高氏一号固体培养基上，28℃培养14d，取插片用台式扫描电镜进行菌株形态观察。

1.2.3.2 培养特征 参照《放线菌的分类和鉴定》［15］和《链霉菌鉴定手册》［16］中的方法。将菌株1-g-59和Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T分别接种于高氏一号琼脂、酵母膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、无机盐淀粉琼脂、葡萄糖天冬素琼脂、胨酵母膏铁琼脂、酪氨酸琼脂等7种培养基中，28℃下培养7-10d，观察菌丝体的颜色及可溶性色素情况。

1.2.3.3 细胞壁化学成分分析 采用Hasegawa等［17］薄板层析法对菌株1-g-59进行全细胞水解液的氨基酸和糖型分析。

1.2.3.4 生理生化特征 参照《放线菌的分类和鉴定》和《链霉菌鉴定手册》中的方法观察菌株1-g-59和Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T的生理生化特性，进行明胶液化、鼠李糖、L-酪氨酸、木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、精氨酸、蛋氨酸、淀粉酶水解、脲酶、H2S的产生等方面的检测。

1.2.3.5 16S rDNA 序列测定及其系统发育分析 基因组DNA提取参照姜淑梅［18］的方法。根据放线菌16S rDNA 的结构特点，PCR 扩增选用通用引物27F ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R ：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反应体系 50μL ：1μL 模板、1μL 引物 1492R 、1μL 引物 27F、25μL PCR mastermix、22μL ddH2O）。PCR 扩增程序 ：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。取50μL PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察、并拍照保存。

电泳完成后的凝胶，经拍照保存后，对大小约为1500bp的条带进行切胶回收。回收片段装入2mL无菌离心管中，用爱思进生物技术有限公司提供的AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行回收得到DNA。回收得到的DNA用宝生物工程有限公司提供的pMD18-T Vector 进行克隆。将样品送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

经测序获得拮抗放线菌1-g-59的16S rDNA序列，将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行系统发育分析，采用邻接法（Neighbour-joining，NJ法）构建系统发育树。

2 结果

2.1 放线菌的分离与筛选

共分离出117株放线菌，采用平板对峙法进行复筛，最终筛选出对FOC 4拮抗效果较强的5株放线菌（表1）。

表1 五株放线菌的拮抗效果

2.2 5株拮抗放线菌发酵液对FOC 4抑制作用的测定

2.2.1 对FOC 4菌丝生长的影响 观察培养5d的FOC 4菌丝，发现经不同拮抗菌发酵滤液处理，FOC 4菌丝生长均受到不同程度的抑制，FOC 4直径均＜1.0cm，混-g2-65B发酵滤液使FOC 4菌丝变为紫色，3-M-03B发酵滤液使带靶标菌的培养基块变黑，而1-g-59发酵液处理的FOC 4菌丝几乎消失，靶标菌的培养基块变为黑色，且培养基块底部有浅黄色黏性分泌物产生。此外，显微镜观察发现1-g-59发酵液处理的FOC 4菌丝体畸形、分枝增多、菌丝破裂、消解；而对照FOC 4菌丝细长、光滑、均匀。

2.2.2 对FOC 4孢子萌发抑制作用的测定 结果表明，对照组（CK）的FOC 4孢子萌发率达92％，经拮抗菌发酵液处理的FOC 4孢子萌发均受到不同程度的抑制，混-g2-25A发酵液处理的FOC 4孢子萌发率达88％，抑制率为4.3％；混-g2-65、3-M-03B、混-g2-65B这3株拮抗菌发酵液处理的FOC 4孢子萌发率均小于6.25％，抑制率均大于93.2％；而1-g-59发酵液处理的FOC 4孢子萌发率为0，抑制率达100％。图1为对照组（CK）和1-g-59发酵液处理的FOC 4孢子萌发情况。

图1 1-g-59发酵液对FOC 4孢子萌发的影响

2.2.3 拮抗放线菌1-g-59发酵液对香蕉枯萎病的盆栽效果测定 移栽14d后，处理3（只接种病原菌）的植株出现黄叶，28d后处理3的植株出现假茎开裂，45d后处理3的蕉苗发病严重，有的植株枯死，病情指数为4.24；处理1（清水）的植株均健康生长；处理2（病原菌+发酵液）病情指数为1.49，防治效果为64.9％（表2）。结果表明，拮抗放线菌1-g-59发酵液对香蕉枯萎病有一定的防治效果。

表2 1-g-59发酵液对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

2.2.4 拮抗放线菌1-g-59的分类鉴定

2.2.4.1 形态学特征 菌株1-g-59在高氏一号培养基上培养5d后菌落呈灰白色，单菌落成不规则的圆形，表面干燥、有皱纹。基内菌丝黄褐色，气生菌丝灰白色，无可溶性色素。通过台式扫描电镜观察，发现该菌株气生菌丝发达，非轮生，孢子成直或柔曲的链，气生菌丝形成孢子链，孢子为圆柱状（图2）。

图2 菌株1-g-59的孢子链照片（6400×）

2.2.4.2 培养特征 由表3可以看出，菌株1-g-59在7种培养基中均能生长，但在无机盐淀粉琼脂和甘油天门冬酰胺琼脂培养基上生长得慢，产孢较少；在不同培养基上，基内菌丝颜色有黄褐色、灰黄色、灰色；气生菌丝有灰色、灰白色、白色；在7种培养基中均不产生可溶性色素。

表3 菌株1-g-59在不同培养基上的生长特征

2.2.4.3 细胞壁化学成分 菌株1-g-59全细胞水解液中含有L，L-DAP和甘氨酸，细胞壁属于I型，无特征性糖，糖型C，进一步验证菌株1-g-59为链霉菌属。

2.2.4.4 生理生化特征 由表4可以看出，菌株1-g-59能利用L-酪氨酸木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、精氨酸、蛋氨酸；不能利用棉子糖；水解淀粉能力弱；明胶液化。菌株1-g-59与Streptomyces lunalinharesii的生理生化特征基本相同。

表4 菌株与Streptomyces lunalinharesii表型特征的比较

2.2.4.5 16S rDNA序列测定及其系统发育分析 将菌株1-g-59的16S rDNA进行PCR扩增得到一条1500bp左右的条带，经序列测定，其大小为1576bp。将其DNA序列与NCBI数据库中相应的DNA序列进行BLAST相似性分析，结果表明，与菌株1-g-59的16S rDNA同源性较高的均为链霉菌，其中与之同源性最高的是Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T，相似性达99.26％。根据序列同源性从高到低的原则，挑取11株菌株的16S rDNA序列，运用BionEdit、Mega5.0软件构建系统发育树（图3），菌株 1-g-59与Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T处于同一分支，亲缘关系最近。

图3 依据16S rDNA 序列构建菌株1-g-59与链霉菌属相关种的系统发育树

3 讨论

近年来土传病害的防治研究在中国发展很快，尤其是在水稻、小麦和油菜方面，已有防治稻瘟病、纹枯病、菌核病等病害的生物农药相继问世［19］。但香蕉枯萎病的生物防治研究起步较晚，目前还没有成功的商业化产品。本研究从蕉园的根际土壤中分离出117株放线菌，通过筛选获得5株对FOC 4具有较强拮抗效果的放线菌，其中菌株1-g-59的拮抗效果最强，对FOC 4的菌丝生长和孢子萌发的抑制作用最大，其发酵液处理的靶标菌培养基块底部有浅黄色黏性分泌物产生，这有可能是拮抗菌发酵液产生的具有抑制FOC 4菌丝生长的分泌物，其成分有待进一步研究。菌株1-g-59发酵液能使FOC 4菌丝体畸形、分枝增多、菌丝破裂、消解，还能有效地抑制FOC 4孢子萌发，这与文献报道［20，21］生防菌的作用机制一致；且其发酵液对香蕉枯萎病的盆栽防治效果达64.9％，说明该菌株可能产生对FOC4有拮抗效果的活性物质，具有较好的开发价值。

菌株1-g-59具有典型的链霉菌特征，16S rDNA序列分析表明菌株1-g-59与Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T序列相似性达99.26％，在系统发育树上处于同一分支，亲缘关系最近，且经研究发现二者的形态特征、培养特征、生理生化特征基本相同［22］，因此鉴定菌株1-g-59为Streptomyces lunalinharesii。

本研究为该菌株今后的应用、香蕉枯萎病的生防菌制剂的开发奠定了基础，该菌株的抑菌活性成分以及其抑菌机理还有待进一步的深入研究。

4 结论

通过分离和筛选获得5株对FOC 4具有拮抗作用的放线菌，其中以菌株1-g-59活性最强。菌株1-g-59发酵液能使FOC 4菌丝全部消失，且其对FOC 4孢子萌发的抑制率达100％。菌株1-g-59发酵液对香蕉枯萎病的盆栽防治效果达64.9％。鉴定菌株1-g-59为Streptomyces lunalinharesii。

［1］胡莉莉, 窦美安, 谢江辉, 等.香蕉枯萎病抗病性研究进展［J］.广西热带农业, 2006, 102（1）：16-18.

［2］莫贱友, 郭堂勋, 李华.广西香蕉枯萎病的发生与病原菌鉴定［J］.广西农业科学, 2008, 39（4）：481-484.

［3］陈琼武.乐东县香蕉枯萎病发生状况及防治措施［J］.安徽农学通报, 2008, 14（12）：73.

［4］麦明晓, 黄惠琴, 鲍时翔.香蕉镰刀菌枯萎病4号生理小种研究进展［J］.中国生物防治, 2009, 25（增1）：71-75.

［5］舒肇苏.台湾香蕉病害的防治［J］.柑橘与亚热带果树信息,2000, 16（20）：43-44.

［6］林兰稳, 奚伟鹏, 黄赛花.香蕉镰刀菌枯萎病防治药剂的筛选［J］.生态环境, 2003, 12（2）：182-183.

［7］Getha K, Vikineswary S. Antagonistic effects of Streptomyces violaceusniger strain G10 on Fusarium oxysporum f. sp. cubense race4［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2002, 28（6）：303-306.

［8］Thandavelu R, Paaniswami A, Doraiswamy S, et al. The effect ofPseudomonas fluorescens and Fusarium oxyaporum f. sp. Cubenseon induction of defense enzymes and phenolics in banana［J］.Biologia Plantarum, 2003, 46（1）：107-110.

［9］Chen CY, Wang YH. Enhancement of the ant ifungal activity of Bacillus subtilis F29-3 by the chit inase encoded by Bacillus circulans chi A gene［J］. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 51（6）：451-455.

［10］Perze VL, Batlle A, Fonseca J, et al.Fusarium oxysporum f. sp. cubense in Cuba［A］. Reaction of cultivars and bio-control method 2nd international symposium on fusarium wilt on banana［C］. Salvador de Bahia. Brazil, 2003： 22-26.

［11］孙建波, 王宇光, 赵平娟, 等.香蕉枯萎病生防细菌的筛选、鉴定及其抑菌作用［J］.中国生物防治, 2010, 26（3）：347-351 .

［12］方中达.植病研究方法［M］.北京：中国农业出版社, 1996：151-154.

［13］何欣, 黄启为, 杨兴明, 等.香蕉枯萎病致病菌筛选及致病菌浓度对香蕉枯萎病的影响［J］.中国农业科学, 2010, 43（18）：3809-3816.

［14］沈萍, 范秀容, 李光武.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社, 2007：72-73.

［15］阎逊初.放线菌的分类和鉴定［M］.北京：科学出版社,1992：296-1048.

［16］中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册［M］.北京：科学出版社, 1975：13-15.

［17］Hasegawa T, Takizawa M, Tanida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes［J］. Journal of General Applied Microbiology, 1983, 29（4）：319-322.

［18］姜淑梅, 张龙, 戴世鲲, 等.一种简单、有效的适于PCR操作的放线菌DNA提取方法［J］.生物技术, 2007, 17（1）：39-41.

［19］Rodrigo F, Rosalie R, Andrew M, et al.Streptomyces lunalinharesiisp. nov., a chitinolytic streptomycete isolated from cerrado soil in Brazil［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2008, 58：2774-2778.

［20］孔建, 赵白鸽, 王文夕.枯草芽孢杆菌抗菌物质对镰刀菌抑制的研究［J］.植物病理学报, 1998, 28（4）：327-340.

［21］秦涵淳, 杨腊英, 李松伟, 等.香蕉镰刀菌枯萎病拮抗放线菌的分离筛选及其抑制效果的初步评价［J］.中国生物防治,2010, 26（2）：174-180.

［22］刘邮洲, 陈志谊, 刘永锋, 等.南京地区蔬菜枯萎病菌拮抗细菌的筛选与评价［J］.江苏农业学报, 2004, 20（1）：18-22.