血脑屏障通透性在外伤性癫痫大鼠中的作用机制研究

刘明刚，朱 权，孙美珍，孙 洋，李 伟

外伤性癫痫（post－traumatic epilepsy）是指脑组织从脑外伤开始，经过一定的潜伏期，产生了慢性、复发性、自发性癫痫发作的过程，外伤性癫痫是最适合研究人类癫痫发生机制的模型[1]。癫痫是神经系统常见疾病之一，50%以上病人由各种脑损害引起，即症状性癫痫，而脑外伤后发生癫痫的危险性比正常人高3倍以上，其发生率为4%～53%，占症状性癫痫的首位[2]。外伤性癫痫的发病机制目前尚未完全阐明，最近的临床和动物实验研究表明血－脑屏障（BBB）的破坏在外伤性癫痫的发病机制中起了关键作用[3]。本实验通过自由落体损伤模型分析外伤性大鼠血脑屏障破坏程度与癫痫发作的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雌雄性各半SD大鼠62只，体重200g～250g，由山西医科大学实验动物中心提供。实验前动物均在实验环境下饲养1周，给予适宜温度（23℃～25℃）和24h光照／暗周期，允许自由饮食。将其随机分为3组：空白对照组10只，不给损伤处理；甘露醇应用组26只，给予头部损伤处理，在头部损伤后24h内，用25%甘露醇注射液1.5g／kg尾静脉注射，每天1次，连续3d，以提高血脑屏障的渗透性；模型对照组26只，给予头部损伤处理，用等体积生理盐水尾静脉注射，在头部损伤后24h内应用，每天应用1次，连续用3d。空白对照组再分为两组分别饲养3d和3个月，每组5只；甘露醇应用组和模型对照组再分别各分为3组，饲养3d和7d各8只，饲养3个月各10只。

1.2 动物模型的制备 将SD大鼠用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，顶部去毛，消毒，沿正中线切开头皮暴露颅骨，长度约1.5cm，在矢状缝右侧，据前囟0.15cm，矢状缝0.25cm处为中心开骨窗，直径为0.4cm，但不损伤硬膜，然后将大鼠连到自由落体打击装置上，释放重锤，根据吴旭等[4]研究制作成重型颅脑损伤模型。打击后切口内注入40 000U庆大霉素注射液0.5mL预防感染，缝合头皮。空白对照组仅开颅窗不施加打击。

1.3 方法

1.3.1 BBB通透性测定 饲养3d和7d的大鼠用于血脑屏障通透性的测定。伊文氏蓝（EB）的渗出量与血脑屏障的开放程度成正相关，应用分光光度计在EB最大吸收光谱635nm处检测脑组织中的EB含量，可以作为判断血脑屏障开放程度的一种定量指标，其脑组织EB含量亦代表血清白蛋白的渗出量[5]7μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL、6μg／mL、8 μg／mL、10μg／mL为EB标准浓度，绘制伊文氏蓝标准曲线。

1.3.2 行为学观察 饲养3个月的大鼠用于行为学观察。采用人工观察和视屏监测大鼠24h活动，按Racine’s分级（0级，无惊厥；1级，闭眼、胡须动，口、鼻、面肌阵挛；2级，在1级基础上出现节律性点头；3级，在2级基础上出现前肢阵挛；4级，在3级基础上出现后肢站立；5级，在4级基础上出现跌倒发作）记录大鼠癫痫发作情况。

1.3.3 脑电图采集 模型建立后观察发现有类似癫痫发作2次以上的大鼠进行脑电图信息采集，将大鼠用20%乌拉坦注射液（5mL／kg）麻醉，固定于脑立体定位仪上，用电生理信号采集仪描记大鼠皮层脑电活动，当出现重复暴发性棘波、棘慢复合波或尖波等癫痫样放电波幅超过基线的两倍并持续5s以上时确定为EEG发作。

1.3.4 标本制作 10%水合氯醛注射液3mL／kg腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于解剖板上，剑突下开胸，从心尖部将穿刺针向主动脉方向插入，剪开右心耳，用300mL生理盐水灌注冲洗，接着用4%的多聚甲醛200mL～300mL灌注，在整个灌注过程中可以观察到大鼠全身肌肉颤动，而后逐渐僵硬、强直，再将脑组织完整取出，浸泡于4%多聚甲醛中后固定，4℃冰箱保存，1周内切片。每块厚约2mm，经多聚甲醛固定、石蜡包埋后作连续冠状切片，片厚5μm，每隔2张取1张切片，每例标本取切片不少于8张。

1.3.5 免疫组化染色（SABC法） 切片常规脱蜡至水，用0.3%H2O2室温处理5min～10min以灭活内源性酶，入0.01 mol／L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中微波抗原修复10min，再次PBS漂洗后入5%BSA封闭液，室温20min，后按ABC法行抗GFAP免疫组织化学反应。依次孵育于兔抗胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体稀释液（1∶200），37℃1h；生物素化山羊抗兔IgG（1∶150）37℃20min；SABC（1∶150）37℃20min。以上每一步骤之后均用0.01mol／L PBS（pH7.2～7.6）漂洗5min×3次。苏木素轻度复染，脱水、透明和封片，显微镜观察。以上试剂均购于博士德生物试剂公司。

1.3.6 星形胶质细胞计数 GFAP是星形胶质细胞的特异性标志物，其表达水平可代表星形胶质细胞增生的情况[6]7倍光镜下对海马结构进行GFAP免疫反应阳性细胞计数，每只鼠各取三张切片，每张切片随机选择5个不重复视野取平均值，同时观察该区域GFAP免疫阳性星形胶质细胞的形态。利用Image Pro Plus 5.0图像分析软件分析，取每张切片中GFAP阳性细胞的积分光密度（IOD）平均值。

1.4 统计学处理 使用SPSS17.0统计分析软件进行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行单因素方差分析，计数资料采用χ2检验进行处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠死亡情况 空白对照组无死亡；甘露醇组死亡8只，存活18只；模型对照组死亡7只，存活19只。总死亡率为28.8%（15／52）。

2.2 3组EB含量比较 模型建立后3d和7d，甘露醇应用组、模型对照组与空白对照组损伤侧皮层EB浓度比较有统计学意义（P＜0.01），甘露醇应用组和模型对照组EB比较有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 3组大鼠皮层EB浓度（±s） μg／g

表1 3组大鼠皮层EB浓度（±s） μg／g

组别 损伤侧皮层对侧皮层3d 7d 3d 7d空白对照组 5.83±1.19 5.83±1.19 5.79±1.26 5.79±1.26模型对照组 65.40±9.271） 16.64±1.921） 6.83±1.37 5.54±0.58甘露醇应用组 83.73±8.321）2） 19.44±2.351）2） 12.23±0.89 6.75±2.31与空白对照组，1）P＜0.01；与模型对照组比较，2）P＜0.01

2.3 行为学及脑电图观察 空白对照组未观察到癫痫发作；实验组早期24h至7d内有10只大鼠可以观察到闭眼、胡须动、面肌痉挛和节律性点头等症状。模型建立7d后，3个月内模型对照组存活的7只大鼠中有2只出现面积痉挛、节律性点头症状，持续时间10s～30s；甘露醇组存活的7只大鼠中有2只出现面积痉挛、节律性点头症状，1只出现前肢阵挛，本实验未观察到3级以上的发作。甘露醇组与模型对照组癫痫发作的大鼠数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组大鼠脑电图以9Hz～12Hz的α波或17Hz～19Hz的β波为主，波幅20 μV～80μV。慢性期癫痫大鼠EEG表现为背景节律增快，波幅为150μV～300μV，能观察到明显的棘波、尖波等。

2.4 GFAP阳性细胞形态观察和计数 镜下观察可见皮层内被染成棕褐色GFAP的免疫反应阳性细胞呈弥散分布，细胞胞体肿胀，界限清晰，数量增多，突起增粗，胞核被苏木素复染为深蓝色，较小，居于细胞中央或偏位。对照组大鼠GFAP阳性细胞胞体较小，突起少而细。各组大鼠皮质GFAP阳性细胞数及IOD值见表2。甘露醇应用组、模型对照组大鼠皮质GFAP阳性细胞数及IOD值与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），甘露醇组与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠皮质GFAP阳性细胞数及IOD值（±s）

表2 各组大鼠皮质GFAP阳性细胞数及IOD值（±s）

分组 n 平均阳性细胞数 积分光密度（IOD）空白对照组 5 30.14±3.86 1289±368.45模型对照组 7 46.86±5.331） 2649±348.591）甘露醇应用组 7 52.76±6.521）2） 3210±398.241）2）与空白对照组，1）P＜0.01；与模型对照组比较，2）P＜0.01

3 讨 论

本研究我们通过自由落体致重型颅脑损伤模型研究血脑屏障破坏与癫痫发作之间的关系，给予1 200g＊cm的打击力度造成重型颅脑损伤，损伤的程度越大动物死亡率越高，中重度颅脑损伤死亡率高达30%～40%[7]，本实验大鼠的死亡率为28.8%（15／52），与文献报道相近。实验组分别给予尾静脉注射生理盐水和甘露醇后发现，甘露醇能进一步开放血脑屏障（P＜0.01），但3个月期间观察两组大鼠的致癫痫率无统计学意义（P＞0.05），分析认为一方面是由于样本数量较少，另一方面是观察周期的限制，研究认为大鼠外伤后需经过大约6周至11个月，平均7个月才会有约50%的大鼠产生自发性癫痫发作[8]。但两组星形胶质细胞数比较有统计学意义（P＜0.05），说明血脑屏障开放程度越大，胶质细胞增生越明显。

外伤后往往出现血脑屏障的破坏[9]，近年来，血脑屏障的破坏被认为在癫痫形成过程中发挥重要作用[10]7年Cornford等[11]首先通过观察超微结构研究了血脑屏障与癫痫的关系，随后的试验也证实了血脑屏障破坏后经过一定潜伏期能够诱发癫痫发作[12]，van Vliet等[10]用甘露醇人为造成血脑屏障开放，发现已患有慢性癫痫的大鼠其发作频率较前明显增加，这提示血脑屏障通透性的改变可能是癫痫发作的重要机制。进一步的研究发现血脑屏障破坏后白蛋白渗出在癫痫的发生中起了重要作用，本研究也证实血脑屏障开放后能够引起白蛋白渗出，而且开放程度越大，白蛋白渗出量越多，白蛋白外溢导致脑组织直接暴露于血清白蛋白足以引起癫痫发生[13]，且白蛋白引发的癫痫活动强度表现为剂量依赖式[14]。而白蛋白渗出后是如何引起癫痫发作的，Tomkins等[15]认为无论是血脑屏障破坏还是将白蛋白直接暴露于脑组织，都会引起胶质细胞激活，使其对钾离子的缓冲减弱，细胞外K＋增高，导致神经元过度兴奋。Cacheaux等[16]研究发现血清白蛋白溢出到脑组织后通过转化生长因子β受体（TGF－βRs）被胶质细胞摄取，引起钾内向整流通道（Kir4.1）表达减少，细胞外钾离子积累增加，导致N－甲基－D－天门冬氨酸（NMDA）受体介导的神经兴奋性增高，最终引发癫痫样活动[17]。血脑屏障破坏后，损伤处的脑组织就开始进行一系列的病理变化：神经元坏死和胶质细胞增生[3]，而这些胶质细胞反应性改变称为反应性星形胶质细胞增生，一般涉及星形胶质细胞形态的变化和数量增加[18]，本研究也证实血脑屏障破坏后，会出现星形胶质细胞形态和数量的变化，而且血脑屏障开放程度越大，胶质细胞增生的数量越多。星形胶质细胞的激活是其增生的基础，星形胶质细胞增生可能导致神经细胞外Na＋／K＋浓度平衡失调，使神经细胞兴奋的阈值降低，神经活动过度而发生癫痫[19]。Vessal等[20]给已经发生癫痫的大鼠分别注射生理盐水和L－AA（一种阻断星形胶质细胞增生的氨基酸）观察发现，给予阻断星形胶质细胞增生后，大鼠癫痫发作程度明显减轻，这提示星形胶质细胞的增生在癫痫反复发作中起着重要作用。

本研究发现在脑外伤后的1周左右可观察到大鼠点头、面肌痉挛等癫痫样症状，推测与BBB破坏后早发性神经元异常放电有关[21]，癫痫发作可发生在外伤后早期，但外伤性癫痫需在外伤后数月甚至数年才会发生[15]，然而早发性癫痫的出现却可以大大增加患者发生晚发性癫痫的风险[22]。外伤性癫痫指外伤后1周出现的反复自发性癫痫发作，又称迟发型癫痫，以区别1周内发生的早发行癫痫或24h内出现的即时发作性癫痫，但这种定义在动物模型中尚未定义[8]。在人类外伤后早发性癫痫的发生率约为2.1%～16.9%，以儿童多见[2]。

血脑屏障破坏后引起血清白蛋白外渗到脑组织，血清白蛋白通过转化生长因子β受体被胶质细胞摄取引起胶质细胞激活和增生，激活的星形胶质细胞神经兴奋性增高，最终引发癫痫发作，而增生的异常星形胶质细胞在维持癫痫复发中起着重要作用。血脑屏障破坏在外伤性癫痫的发生、发展中扮演者重要角色，这对研究人类外伤性癫痫的机制有重要的意义。本实验因样本数量及观察周期限制有其局限性，这需要进一步去研究，胶质细胞激活后究竟释放何种因子及具体相关机制仍需做更深的探讨。

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