糖尿病并脑梗死大鼠模型的建立体会

王海涛，杨明峰，孙保亮，曹晓岚

随着社会人口老龄化及生活方式的改变，糖尿病的患病率呈逐年上升趋势，严重威胁人类健康。临床上反复发作的缺血性脑卒中患者10%～30%合并有糖尿病；缺血性脑卒中死亡病人中，糖尿病是非糖尿病病人的2倍或以上。因此糖尿病与脑缺血的关系日益受到人们的重视。糖尿病合并脑梗死时脑损伤机制亟需满意的动物模型来模拟实际的发病情况，目前，国外用于糖尿病研究的动物模型多为遗传型[1]，如ob／ob小鼠、db／db小鼠及肥胖型Zucker大鼠、OLETF大鼠等，其来源在我国相当困难且十分昂贵，不利于研究的开展。国内有采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱发慢性实验性糖尿病大鼠，在此基础上制作大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型[2－5]，但因所选糖尿病模型和脑缺血模型的不同，结果不尽一致。本实验在鼠糖尿病模型的基础上，应用线栓法制备大鼠MCAO模型，成功制备了糖尿病并脑梗死大鼠模型，现将实验操作方法及所得经验教训总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组 健康5周龄雄性Spraque－Dawley（SD）大鼠40只，随机分为假手术对照组（Sham组）、单纯脑梗死组（MCAO组）、单纯糖尿病组（DM组）、糖尿病脑梗死组（DM＋MCAO组），每组10只。假手术对照组及单纯脑梗死组给予普通饲料喂养，单纯糖尿病组和糖尿病脑梗死组给予高脂高糖饲料喂养，实验过程不合格及死亡大鼠在后续试验中予以补齐。1.1.2 主要试剂与材料 普通饲料和高脂高糖饲料（普通饲料中添加10%猪油、10%蛋黄粉和20%蔗糖）。饲料由泰山医学院实验动物中心提供，喂养前1周临时配制，压制成形后喂养。STZ由美国Sigma公司生产；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）：北京索莱宝公司产品。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病动物模型的制备 参照文献[6]制作糖尿病大鼠模型，高脂高糖饲料喂养至4周后，所有动物称重并测量血糖，继之用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病模型。STZ浓度为30mg／kg，注射前将STZ溶于pH为4.5的0.1mmol／L的柠檬酸缓冲液中。假手术对照组和单纯脑梗死组注射同等容积的柠檬酸缓冲液，不加入STZ。随后继续按照原来饲料喂养方式喂养1周，用血糖仪测定血糖，若血糖≥16.7mmol／L，则判定为糖尿病大鼠[6]，动态观察大鼠症状和体征，淘汰血糖不达标大鼠。

1.2.2 脑梗死模型的制备 参照经典的Longa不开颅经颈总动脉栓入尼龙线致大脑中动脉闭塞的方法[7]，腹腔内注射水合氯醛（300mg／kg）麻醉，做颈部正中切口，自颈总动脉分叉处做一微切口，插入用浓盐酸硝酸预混液预处理过的3号鱼线（0.26mm直径），插入深度18mm～20mm。假手术对照组和单纯糖尿病组同样进行手术，但线栓插入深度为10mm并且1 min后拔出。

1.2.3 糖尿病脑梗死模型的建立 高脂高糖饲料喂养4周，进行腹腔STZ注射，2周后测定血糖，筛选血糖合格糖尿病大鼠，进行线栓法制作脑梗死模型，进行观察评价，有神经功能缺损者为成功模型。

1.2.4 神经功能评分标准 大鼠清醒后，大鼠全部进行行为学观察，进行神经功能评分，参照Bederson等[8]的评定方法进行神经功能评分：0分无症状；1分为提鼠尾时瘫痪侧前肢回收屈曲；2分为除1级体征外，大鼠向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低；3分为除以上体征外，大鼠爬行时向瘫痪侧旋转；不能自发行走，意识丧失为4分。评分为1分～3分则为造模成功。0分和4分者剔除。

1.2.5 脑梗死体积测定 MCAO手术后6h，大鼠断头取脑，放入冰盐水中肉眼观察大脑中动脉（MCA）系统有无血栓形成及脑组织水肿情况，颅底有无出血，迅速置于－20℃冰箱中冷冻20min，行冠状切片，每片厚2mm，放入2%的TTC液中，置37℃温水浴30min染色。正常组织被染成红色，坏死组织不着色。数码相机拍照后，应用图像处理软件，计算脑梗死体积。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件包分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠生存状态 正常对照组大鼠体重增加正常，反应灵敏，毛色光泽。高脂高糖饲料喂养大鼠腹腔注射链脲佐菌素后，大鼠饮食量、饮水量明显增加，排尿增多，体重增长缓慢，甚至出现负增长，精神萎靡，反应迟钝，毛色失去光泽枯黄竖起。

2.2 神经功能评分及死亡率 假手术对照组和单纯糖尿病组神经功能缺失评分均为0分；单纯脑梗死组和糖尿病脑梗死组大鼠均出现不同程度的神经行为学异常，主要表现为右侧霍纳征（上睑下垂，瞳孔散大）和左侧前肢为重的瘫痪，表现为提尾时左侧肢体屈曲内收紧贴胸壁，行走时有左侧转圈，或向左侧倾倒等。脑梗死组神经功能评分均高于假手术组，提示脑梗死模型造模成功；糖尿病脑梗死组大鼠神经功能评分显著高于单纯脑梗死组（P＜0.05），提示糖尿病大鼠脑梗死后显示更大的神经功能损伤。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（±s） 分

表1 各组大鼠神经功能评分比较（±s） 分

组别 n 神经功能评分Sham组10 0 MCAO组 10 2.4±0.51）DM组 10 0 DM＋MCAO组 10 2.7±0.41）2）与Sham组比较，1）P＜0.05；与MCAO组比较，2）P＜0.05

2.3 梗死体积测定 TTC染色显示梗死区域为苍白色，假手术组及单纯糖尿病组大鼠脑组织未见梗死灶，经大脑中动脉线栓的大鼠有不同程度的梗死灶，梗死范围较恒定，主要位于大脑中动脉分布区（额顶背外侧皮层、尾壳核区）。其中以糖尿病脑梗死组大鼠梗死体积最大，为（82.6±7.5）%，严重者几乎全部一半的脑组织均见梗死灶，与单纯脑梗死组相比，超过单纯脑梗死组梗死容积的2倍，提示糖尿病后脑梗死体积增大。

2.4 模型成功情况 试验过程中假手术组无大鼠死亡，单纯脑梗死组在MCAO操作后因死亡补充4只，单纯糖尿病组因死亡补充1只，因血糖不合格淘汰大鼠2只，糖尿病脑梗死组因死亡补充7只，淘汰血糖不合格大鼠2只，糖尿病脑梗死模型成功率52%。

3 讨 论

高脂高糖喂养联合小剂量STZ注射能复制出接近2型糖尿病临床特点的大鼠模型，在糖尿病模型基础上制作的脑梗死模型是研究糖尿病脑梗死较为理想的模型。实验过程中的很多因素都能决定着动物模型是否能够成功，现将在实验过程中发现的经验教训总结如下。

3.1 大鼠选择 空腹成年雄性鼠造模，糖尿病成模率较高，较幼鼠或小体重鼠更易成模型[9]。高脂高糖饲料喂养4周，大鼠体重增加明显，但制作糖尿病模型后，大鼠体重增长缓慢，到进行线栓法阶段，体重基本平衡。研究选用5周龄的SD大鼠为研究对象，初始大鼠重量为170g～190g，在进行大鼠 MCAO模型制作阶段重量控制在280g～310g。

3.2 药物选择 链脲佐菌素和四氧嘧啶均可用于糖尿病模型的制作，但用四氧嘧啶造模2周～3周后可有自然阴转，且造模初期病死率较大，文献报道较多使用链脲佐菌素造模。但要注意链脲佐菌素溶液配制后需避光冰浴，并且在30min内注射完毕，否则会对造模有影响。还要注意注射部位要正确，避免注射药物误入皮下，降低成模率，或因腹腔注射范围大，注射药物易误入腹腔脏器，导致死亡率增高等。

3.3 栓线选择 大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制作过程中对栓线的选取十分严格，它直接影响实验的成败。一般选用尼龙线为栓线，栓线的粗细与所选大鼠的体重密切相关，考虑一般选用300g左右的大鼠，故所选栓线的直径宜为0.25mm，该直径既易于穿入大鼠大脑中动脉又能完全阻断大脑中动脉。插线的深度也是影响结果的重要因素，在操作之前用细标记笔在18.5mm处分别作标记。在操作的过程中笔者发现从残端算起插线深度18.5mm左右，能制作比较符合要求的模型。避免栓线在血管内来回反复穿插而损伤血管内皮，继发血栓形成。

3.4 关于麻醉 用10%的水合氯醛，按350mg／kg给药。有报道认为避免麻醉过量，先给予总量的2／3，如麻醉不够再加量。在实践中此法不大可取。应该一次性给予总量，否则麻醉效果不佳，再次注射多会抑制呼吸引起死亡。按以上麻醉剂量，大鼠2h后多会醒来，此时可通过了解大鼠是否有神经功能缺损以判断栓塞是否成功。

3.5 关于护理 在手术中曾遇到大鼠呼吸急促、气道分泌物增加，以至于大鼠死亡的现象，所以一定要保持呼吸道通畅，可在手术中将大鼠舌头拉向一侧，这样明显减少肺水肿的发生。麻醉期间一定要保温，如保温不当，大鼠死亡率会大幅增加。醒后室温宜保持在26℃～30℃。大鼠手术暴露处术中组织液挥发较多，故可考虑腹腔补1mL～2mL的生理盐水，如术中有出血或操作时间过长，可适当加量。

3.6 手术操作 分离血管要较彻底，避免结扎、牵拉伴随的神经。翼腭动脉的处理，颈内动脉在入颅前有一个粗大的分支腭翼动脉，在分离时切忌不能损伤这个血管，插线的过程中线栓可能会误入此分支血管，所以在操作过程中要予以注意。插完后进行检查，防止误入此血管。

总之，建立具有重复性、稳定性好，生理指标控制严格的标准化模型是研究糖尿病并脑梗死必不可少的工具，而在实际操作中每个细节往往都影响着模型的质量，所以，重视并严格操作实验中的每一个步骤，不断总结经验，模型制作就会越来越完善。

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