丙戊酸抑制大鼠实验性自身免疫性神经炎机制研究

贲 莹，张凤华，梁文杰，张 冬，方 倩

实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)是一种由T细胞介导的炎性脱髓鞘性周围神经系统的自身免疫性疾病，与格林－巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)的临床表现和免疫学特点相似。GBS的病因治疗主要为免疫球蛋白静脉滴注和血浆置换，费用昂贵，且治疗后仍有约25%的患者有肢体无力等后遗症。丙戊酸是由8个碳原子和脂肪酸支链组成的简单化合物，临床用于抗惊厥和癫痫治疗。近年来研究发现，丙戊酸能拮抗多种损伤因素诱导的神经细胞凋亡，还能减少肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)产生，抑制核转录因子-κB(NF-κB)激活，发挥抗炎作用，对抗炎症诱导的神经细胞损伤［1］。本研究应用丙戊酸钠治疗EAN大鼠，观察治疗效果，分析治疗作用机制，为临床治疗GBS提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 Lewis雄性大鼠36只，鼠龄8～10周，体重170～200 g，清洁级，购自河北医科大学实验动物中心。注射用丙戊酸钠购自Sigma公司。周围神经髓鞘抗原(P257-81)多肽购自上海吉尔生化有限公司;ED1抗活化的巨噬细胞抗体、CD3抗T淋巴细胞抗体购自Serotec公司;IL-17抗体、Foxp3染色缓冲组合购自eBioscience公司。总RNA提取试剂(Trizol)、逆转录试剂盒购自大连宝生物有限公司，引物参照Gene Bank序列，应用Primer Express 5.0软件合成，由大连宝生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分组:将实验大鼠随机分为治疗组、模型组和正常组各12只。

1.2.2 模型建立:模型组及治疗组大鼠双后肢足底注射 200 μl抗原乳剂［将 100 μl完全弗氏佐剂(CFA)和含 P257-81(100 μg)的 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)100 μl用针式匀浆器混匀成油包水乳剂］。免疫当天记为第0天。治疗组于免疫0～15 d每天固定时段于大鼠腹腔注射300 mg/kg丙戊酸钠(用1 ml PBS溶解稀释)，模型组、正常组在同时点注射等量的PBS。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 发病情况评估:免疫后每天对大鼠进行神经系统体征评分［2］:0分:无异常;1分:尾部张力降低;2分:尾瘫，翻正反射部分缺失;3分:翻正反射缺失;4分:步态失调、姿态异常;5分:后肢轻瘫;6分:中度瘫痪;7分:后肢严重瘫痪;8分:四肢瘫痪;9分:濒死;10分:死亡。

1.2.3.2 坐骨神经病理及免疫组化改变:于免疫第16天断头处死大鼠，取部分坐骨神经根置于10%甲醛溶液中固定24 h，流水冲洗1 h，制成石蜡块，切片行HE染色，光镜下观察病理改变。

用免疫组化法对T细胞、巨噬细胞浸润的情况进行检测。常规脱蜡、灭活内源酶、微波修复抗原、滴加10%标准猪血清封片。加一抗:CD3抗T淋巴细胞(1∶50)，ED1抗活化的巨噬细胞(1∶100)，于4℃孵育过夜。加二抗室温孵育，滴加S-A/HRP，37℃孵育20 min，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木素轻度复染、封片、观察。应用Image-Pro Plus系统(×400)采集图像，进行阳性细胞面积分析，结果用阳性细胞面积占坐骨神经横切面面积的百分比表示。

1.2.3.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg细胞检测:采集大鼠外周血100 μl，加入红细胞裂解液，用含0.5%皂甙的缓冲洗液透化处理10 min。在室温下用兔抗鼠IL-17抗体(1∶100)进行细胞孵育1 h。应用缓冲洗剂清洗2次，于暗室内用FITC-标记的羊抗兔Ig-F(ab)2片段(1∶100)进行孵育1 h，而后进行流式细胞检测。

采集大鼠外周血100 μl，加红细胞裂解液，振荡混匀后静置10 min，离心，去上清，加PBS洗2遍，取100 μl放入流式管。加入 CD4-FITC、CD25-APC，预冷的PBS洗涤细胞，重悬细胞后加入破膜工作液混匀，避光4℃孵育30 min，加入Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞，弃上清液。加入稀释血清，避光孵育15 min，加入荧光标记Fox3抗体，避光孵育40 min，加入Permeabilization Buffer洗涤细胞去上清。用Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，上机检测。

1.2.3.4 大鼠淋巴结中细胞因子的变化:用Trizol法从大鼠腹股沟淋巴结中提取RNA，－70℃保存。用逆转录聚合式酶联反应(RT-PCR)技术检测TNF-α、γ 干扰素(IFN-γ)、IL-17、β 型转化生长因子(TGF-β)的mRNA表达水平。引物序列:

取RT-PCR产物5 μl经2%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统成像，半定量分析用Quantityone软件测定各电泳条带光密度值，按公式:mRNA相对光密度值=目的条带光密度值/甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)的光密度值，将表达量化。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较采用t检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 发病情况 治疗组发病时间较模型组显著延迟，疾病高峰期(免疫后第15天)神经系统体征评分明显低于EAN模型组(P＜0.05)，见表1。

表1 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组发病时间及神经系统体征评分(±s)

表1 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组发病时间及神经系统体征评分(±s)

注:治疗组为于免疫0～15 d每天固定时段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸钠(用1 ml PBS溶解稀释)，模型组为免疫后同时点注射等量PBS;aP＜0.05

组别 只数 发病时间(d)神经系统体征评分(分)治疗组 12 12.02 ±1.64a 2.63 ±1.09a 12 9.11 ±1.16 6.58 ±1.70模型组

2.2 坐骨神经的髓鞘脱失和炎性细胞浸润情况治疗组坐骨神经血管周围髓鞘脱失及炎性细胞浸润情况较模型组显著减轻(图1)。模型组坐骨神经有大量T细胞和巨噬细胞浸润，其中以巨噬细胞为多，治疗组细胞浸润较模型组明显减少(P＜0.05)(图2、3，表 2)。

图1 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组坐骨神经切片病理结果(HE×400) A.模型组;B.治疗组

图2 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组坐骨神经切片CD3免疫组化染色结果(HE×400)

图3 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组坐骨神经切片ED1免疫组化染色结果(HE×400)

表2 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组坐骨神经切片T细胞、巨噬细胞阳性面积(±s，%)

表2 大鼠实验性自身免疫性神经炎模型组和治疗组坐骨神经切片T细胞、巨噬细胞阳性面积(±s，%)

注:治疗组为于免疫0～15 d每天固定时段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸钠(用1 ml PBS溶解稀释)，模型组为免疫后同时点注射等量PBS;aP＜0.05

组别 只数 T 细胞 巨噬细胞治疗组 12 0.24 ±0.10a 1.67 ±1.16a 12 0.58 ±0.14 6.15 ±1.49模型组

2.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg细胞检测情况模型组与治疗组外周血中Th17、Foxp3+Treg细胞所占百分比均显著高于正常组(P＜0.05);治疗组外周血中Th17细胞所占百分比显著低于模型组，Foxp3+Treg细胞所占百分比显著高于模型组(P＜0.05)，见表3。

表3 3组外周血中Th17和Foxp3+Treg细胞所占比例(±s，%)

表3 3组外周血中Th17和Foxp3+Treg细胞所占比例(±s，%)

注:治疗组为于免疫0～15 d每天固定时段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸钠(用1 ml PBS溶解稀释)，模型组和正常组均同时点注射等量PBS;与正常组比较，aP＜0.05;与模型组比较，cP ＜0.05

组别 只数 Th17细胞 Foxp3+Treg 细胞治疗组 12 1.85 ±0.46ac 15.09 ±1.34ac 12 1.18 ±0.26 5.03 ±0.94模型组 12 3.67 ±0.38a 6.26 ±0.75a正常组

2.4 淋巴结中细胞因子表达情况 模型组与治疗组淋巴结中 TNF-α、IFN-γ、IL-17 和 TGF-β 的 mRNA表达水平均较高于正常组(P＜0.05);治疗组大鼠淋巴结中TNF-α、IFN-γ和IL-17的mRNA表达水平低于模型组，TGF-β的mRNA表达水平高于模型组(P ＜0.05)，见表4。

表4 3组淋巴结中细胞因子mRNA表达情况(±s，%)

表4 3组淋巴结中细胞因子mRNA表达情况(±s，%)

注:治疗组为于免疫后0～15 d每天固定时段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸钠(用1 ml PBS溶解稀释)，模型组和正常组均同时点注射等量PBS;TNF-α为肿瘤坏死因子α，IFN-γ为γ干扰素，IL-17为白介素17，TGF-β为β型转化生长因子;与正常组比较，aP ＜0.05;与模型组比较，cP ＜0.05

组别 只数 TNF-α IFN-γ IL-17 TGF-β治疗组 12 0.38 ±0.02ac0.45 ±0.08ac0.63 ±0.17ac0.74 ±0.15ac 12 0.17 ±0.05 0.23 ±0.04 0.36 ±0.09 0.28 ±0.13模型组 12 0.63 ±0.04a 0.75 ±0.03a 1.29 ±0.11a 0.62 ±0.16a正常组

3 讨论

GBS是由于非特异性感染所引起的自身免疫性多发性周围神经病。在病理方面，活化的辅助性T细胞可识别抗原呈递细胞上的周围神经自身抗原，对EAN的启动起着重要作用［3］。活化的巨噬细胞通过直接的吞噬攻击和分泌炎性介质引发髓鞘脱失，清除巨噬细胞并抑制其活性可抑制EAN的发展［4］。本研究结果显示，丙戊酸减少了周围神经系统中T细胞、巨噬细胞的浸润，因此，该药能够使局部炎症减轻，髓鞘脱失减少，使EAN病情得到改善。

细胞因子对炎症和免疫有重要的调节作用。IFN-γ、TNF-α能够激活巨噬细胞，增加血－神经屏障的通透性。其中，IFN-γ能诱导血旺细胞、巨噬细胞主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原(MHC-Ⅱ)表达，TNF-α能上调iNOS特异性mRNA在施万细胞表达，促进释放 NO。IL-17能诱导 TNF、IL-6、黏附分子1(ICAM-1)、NO和前列腺素E2的产生，促进T细胞激活，引起组织损伤［5-6］。TNF-α、IFN-γ、IL-17这些促炎细胞因子在EAN中起着启动和促进作用［7］。TGF-β具有抑制抗原呈递细胞及拮抗效应性T细胞的功能，并可诱导初始CD4+T细胞转化为Foxp3+Treg 细胞，从而抑制免疫应答［8］。TGF-β 在EAN中起着控制炎性反应、促进组织修复的作用［9］。免疫应答时细胞因子谱系的产生决定着免疫应答的结局。本研究结果显示，丙戊酸能减少TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA 的表达，增加 TGF-β mRNA的表达，从而使EAN的自身免疫应答减轻。

Th17和Foxp3+Treg细胞同属于CD4+T细胞。Th17 细胞通过分泌 IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α、集落刺激因子等促炎细胞因子参与自身免疫，在诱导自身免疫的组织损害及炎症过程中起着决定性的作用。Th17细胞能促进多种自身免疫性疾病发生，如多发性硬化、类风湿性关节炎、狼疮、哮喘等［5］。Foxp3+Treg细胞能够直接抑制T细胞，并可分泌TGF-β抑制免疫系统的激活，并因此预防了过度的炎性反应和(或)自身免疫，从而致免疫耐受和免疫稳态［10］。Foxp3+Treg细胞能够减弱自身免疫疾病实验动物模型中(包括自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病、胃炎、狼疮、前列腺炎和甲状腺炎等)的免疫应答［11］。Th17和Foxp3+Treg细胞两者相互拮抗，从而维持机体免疫状态相对稳定。本研究结果显示，丙戊酸可使 EAN大鼠外周血中Th17细胞减少，Foxp3+Treg细胞增加，以减轻病情。

丙戊酸是临床治疗双重精神障碍和癫痫的常用药物。近年来发现其作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)可抑制 HDAC活性，通过改变组蛋白乙酰化水平达到染色质结构重塑，从根本上调节基因表达［12］。目前的研究表明，HDACi在多种动物模型中具有抗炎作用，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等［13］。HDACi能增加激活的Foxp3+Treg细胞的数量［14］，调节 T细胞分化，有效地减少促炎细胞因子如 IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-6、IL-17 和 IL-17F 的表达［13］。因此，丙戊酸可能通过对HDAC的抑制效应减轻EAN的症状。

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