水飞蓟素对肾小管间质纤维化大鼠中生长因子-β1表达的影响

王成祥 韩子明

肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fibrosis，TIF)几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结局，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一［1］。这个过程受许多因素影响，其发展机制涉及许多方面。近年来研究表明转化生长因子-β1(TGF-β1)在TIF进程中具有重要的促进作用［2］。本文旨在探讨应用水飞蓟素延缓肾小管间质纤维化可能机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物模型及分组 选用3月龄SD大鼠56只，体重200～250 g，随机分为:梗阻组(24只)、治疗组(24只)、假手术组(8只)。大鼠行氯胺酮50 mg/kg麻醉，取左旁正中切口剪开腹壁，以4号手术线将左输尿管近端两处结扎。假手术组同样处理但不结扎。其中于术前30 min治疗组开始给予水飞蓟素30 mg/kg灌胃，1次/d;假手术组和梗阻组给予等量生理盐水灌胃处理。UUO大鼠于术后第7天、14 d、21 d随机收获8只，假手术组于第21天一次处死。取肾脏，10%多聚甲醛固定。免疫组织化学法检测肾脏TGF-β1的表达情况和RTPCR法检测各组肾组织TGF-β1mRNA表达水平。实验过程中梗阻组第14天、21 d时间点各死亡大鼠1只。

1.2 免疫组化 采用SABC法检测肾组织中的TGF-β1，操作步骤按SABC试剂盒说明书进行。高倍镜(×200)下在每张不包含肾小球和血管的肾小管间质区域随机选取10个不重叠的视野，应用IDA-2000高清晰度数码图像分析系统进行图像采集，经灰度变换将阳性染色区域面积与该视野总面积百分比，计算平均值作为该样本的百分比值。

1.3 RT-PCR PCR引物合成:上海申工生物工程公司。引物序列及产物如下。

引物 序列产物长度TGF-β1 引物5'TAA TGG TGG ACC GCA ACA ACG 3' 680bp 5'CTT GCT GTA CTG TGT GTC CAG 3'β-actin引物 5'CTT TTG TGC CTT GAT AGT TC 3' 265bp 5'GAG TCC TTC TGA CCC ATA C 3'

采用凝胶成像摄片及分析用琼脂糖凝胶电泳图像分析系统(SYNGENE公司)在紫外光下采集图像并分析，分析时TGF-β1与β-actin扩增条带的吸光度值比值作为各指标mRNA相对表达水平。

2 结果

2.1 肾组织免疫组化变化 假手术组肾组织微量表达TGF-β1，主要位于肾小球系膜和上皮细胞，小管主要表达于远曲小管;梗阻组和治疗组肾组织表达TGF-β1逐渐增强，遍布皮髄质损伤的肾小管，除肾小管上皮细胞有阳性表达外，增殖的单核巨噬细胞TGF-β1亦有表达。各观察时间点治疗组较梗阻组减少(P＜0.05)。见表1。

2.2 RT-PCR结果 假手术组大鼠肾脏存在少量TGF-β1mRNA表达。UUO大鼠各组随着病情进展，肾组织表达TGF-β1mRNA逐渐增强，高峰持续至21 d实验结束。治疗组肾脏组织表达TGF-β较梗阻组减少(P均＜0.05)，见图1。各组在肾组织表达变化见表1。

表1 各组大鼠肾组织TGF-β1及mRNA表达(±s)

表1 各组大鼠肾组织TGF-β1及mRNA表达(±s)

注:★P＜0.05 compared with sham operated group;◆P＜0.05 compared with operated group

鼠数 TGF-β1 TGF-β1 mRNA假手术组21 d 8 0.21±0.08 0.28±0.04梗阻组 7 d 8 2.24±0.21★ 0.63±0.13★14 d 7 5.43±0.18★ 0.99±0.16★21 d 7 6.08±0.12★ 1.47±0.14★治疗组 7 d 8 1.34±0.22★◆ 0.47±0.08★◆14 d 8 4.19±0.21★◆ 0.68±0.11★◆21 d 8 2.0846±0.2017★◆ 0.76±0.15★◆

图1

3 讨论

水飞蓟素是从水飞蓟植物提取的混合物，是一种黄酮醇类化合物，主要含水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟醇等。水飞蓟素作为一种传统药物曾广泛用于防治肝脏纤维化。它主要通过下调TGF-β1在肝内的表达，改变肝枯否细胞的功能，抑制炎症反应，有效阻止肝纤维化［3］。韩子明等［4］应用水飞蓟素治疗大鼠肾小管间质纤维化，明显延缓了肾小管间质纤维化。TGF-β1表达增加与肾间质纤维化关系密切。本实验研究结果显示:梗阻组、治疗组肾组织表达TGF-β1逐渐增强，遍布皮髄质损伤的肾小管，除肾小管上皮细胞有阳性表达外，增殖的单核巨噬细胞TGF-β1亦有表达。RT-PCR结果显示TGF-β1mRNA与蛋白表达水平在UUO大鼠术侧肾脏渐进性增加的情况，反映了相似的分布变化规律。这与文献报道相一致。经水飞蓟素治疗的治疗组肾脏组织各观察时间点TGF-β1mRNA与蛋白表达均较梗阻组减少(P＜0.05)。上述说明TGF-β1在肾小管间质纤维化中起着重要作用，水飞蓟素通过下调TGF-β1的表达，延缓肾小管间质纤维化。但是，肾小管间质纤维化发病机制十分复杂，关于水飞蓟素在缓解肾小管间质纤维化作用机制方面还有待进一步深入研究。

［1］Li M.X，Liu B.C.Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis.Chinese Medical Journal，2007，120，1925–1930.

［2］Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol.2008，214:199-210.

［3］Jeong DH，Lee GP，Jeong WI，et al.Alterations of mast cells and TGF-betal on the silymarin treatment for CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol，2005，11(8):1141-8.

［4］韩子明，赵德安，赵海霞.水飞蓟素对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化的干预作用.实用儿科临床杂志，2008，17:136-8.