王俊彤 郑喜群 刘晓兰
(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)
高血压是一种以动脉收缩或舒张压升高为特征的临床综合症,它会对大脑、心血管及肾脏造成损害[1]。血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)是影响人体血压平衡的重要因素[2]。目前,治疗高血压的药物多为化学合成的ACE抑制剂(ACEI)。这些药物虽然效果显著,但长期服用会对人体产生各种不良反应,且停药后血压易反弹。与此相比,以动植物为来源的降血压肽不仅具有良好的降血压效果,而且无毒副作用,适合各种人群服用[3]。
玉米黄粉(corn gluten meal,又称玉米蛋白粉)是玉米湿法加工淀粉过程中的主要副产物之一,含有62%~71%的蛋白质[4]。由于玉米黄粉成分复杂,口感粗糙,水溶性低,功能特性差,难以直接利用[5]。但玉米蛋白的氨基酸组成独特,含有高比例的亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸,很少含有赖氨酸等碱性氨基酸,这使它成为制备多种生理活性肽,特别是降血压多肽的良好来源[6]。风味蛋白酶包含内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性,适用于生产低苦味多肽,能够较好的改善水解物的风味[7]。另外,它是由微生物发酵而得,价格便宜,适合工业生产。因此,利用风味蛋白酶水解玉米黄粉,可以获得ACE抑制率较高及风味较佳的玉米肽产品。本研究以玉米黄粉为原料,对风味蛋白酶水解制备降血压肽的工艺进行初探,旨在为ACE抑制肽的分离纯化及工业化生产提供理论依据和工艺参考。
1.1.1 材料与试剂
玉米黄粉:蛋白质含量56.24%,黑龙江龙凤玉米开发有限公司;
α-淀粉酶:酶活为2.85×103U/g,北京双旋微生物培养基制品厂;
Flavourzyme风味蛋白酶:酶活为3.37×104U/g,丹麦NovoNordisk公司;
ACE、Hip-His-Leu(HHL):美国Sigma公司;
其他试剂:均为分析纯,市售。
1.1.2 主要仪器设备
台式离心机:TCL-16G型,上海安亭科学仪器厂;
电热恒温鼓风干燥箱:101-3-S型,上海跃进医疗器械厂;
水浴恒温振荡器:SHZ-88型,上海跃进医疗器械厂;
pH计:pB-10型,赛多利斯科学仪器有限公司;
Beckman分光光度计:DU800型,美国Beckman公司。
1.2.1 玉米黄粉的预处理方法 采用挤压膨化和去淀粉处理[8]。将玉米黄粉用双螺杆膨化机膨化。调节玉米黄粉含水量至16%,膨化机在160~180℃,1.0~1.5MPa条件下进行膨化。膨化后在室温下干燥,粉碎、过60目筛。再用pH 6.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲将挤压膨化后的玉米黄粉配制成浓度为10%(m/V)的悬浮液。加入α-淀粉酶(30U/g),60℃水解2h。反应结束后酶解液在100℃灭酶30min。水解后沉淀用等量的水洗涤3次,彻底去除淀粉水解的产物。最后将去掉淀粉的玉米黄粉在60~70℃的烘箱中烘干,粉碎,作为蛋白酶酶解试验的原料。
1.2.2 风味蛋白酶Flavourzyme水解玉米黄粉的条件优化
用磷酸盐缓冲液将预处理的玉米黄粉配制成一定浓度的悬浮液,进行Flavourzyme催化水解反应,每隔一定时间取适量水解液,立即于沸水中加热20min以钝化酶活力,4 000r/min离心20min,测定上清液中ACE抑制率。以水解温度、水解液pH、底物浓度和加酶量为因素进行单因素和正交试验,确定风味蛋白酶水解玉米黄粉的最佳条件。
单因素试验方法:① 温度对玉米黄粉水解物ACE抑制率 的 影 响:在 底 物 浓 度 为 5%(m/V), 加 酶 量 为3% (m/m),水解液pH 6.0条件下,考察温度分别为45,50,55℃时对Flavourzyme催化水解反应的影响;② 水解液pH对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响:在底物浓度为5% (m/V),加酶量为3% (m/m),温度为50℃条件下,考察水解pH分别为6.0、6.5和7.0时对Flavourzyme催化水解反应的影响;③ 底物浓度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响:在加酶量为3% (m/m),水解液pH 6.0,温度为50℃条件下,考察底物浓度分别为4%、5%和6%(m/V)时对Flavourzyme催化水解反应的影响;④ 加酶量对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响:在温度为50℃,底物浓度为5%(m/V),水解液pH 6.0条件下,考察加酶量分别为2%、3%和4%(m/m)时对Flavourzyme催化水解反应的影响。
1.2.3 ACE抑制率的测定 参照 Cushman[9]紫外分光光度法的基本原理测定。
1.2.4 不同分子量水解产物的制备 选用截留分子量为10kDa和6kDa的中空纤维素膜对玉米黄水解液进行超滤处理,将水解液分为>10kDa,6~10kDa,<6kDa 3个组分。超滤压力0.1MPa,温度为室温。
由图1可知,随着温度升高,水解物ACE抑制率增加,但温度过高时,水解物ACE抑制率反而降低,可能是由于Flavourzyme不耐高温,高于50℃时会使其分子的次级键断裂,使蛋白酶变性,酶分子的活性减弱甚至完全失活,导致水解物中ACE抑制肽产率降低。温度为50℃时,水解物ACE抑制率最高,其次是45℃。因此选择酶解温度为50℃。
图1 温度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响Figure 1 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM
由图2可知,Flavourzyme为酸性蛋白酶,在较低的pH范围内,具有较强的酶解能力。水解反应初期,不同pH条件下水解物ACE抑制率相当,随着水解时间的延长pH 6.0的水解物ACE抑制率变化较为平稳,而其它水解反应进行6h时,ACE抑制率都有明显降低,随后又逐渐增大。其中pH 6.5、水解8h时,水解物 ACE抑制率最高,达67.46%±3.45%,因此,选择pH 6.5为最适pH。由于水解过程复杂,水解反应进行中,不断有肽键发生断裂和缩合,导致水解产物的ACE抑制率呈现波浪式变化。
图2 pH对玉米蛋白粉水解物ACE抑制率的影响Figure 2 Effect of pH on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM
由图3可知,随着底物浓度的增加,水解物ACE抑制率呈先增大后减小的变化趋势,适当增加底物浓度使蛋白酶作用位点增多,酶与底物充分结合,ACE抑制肽含量增加。但底物浓度过高,会对酶产生竞争性抑制,水解反应变弱。当底物浓度为5%时,水解物ACE抑制率最高,继续增加底物浓度并没提高ACE抑制率。因此,选择底物浓度为5%。
图3 底物浓度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响Figure 3 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM
由图4可知,当加酶量较低时,有足够的底物与酶结合,水解物ACE抑制率与加酶量成正比;当加酶量较高时,玉米黄粉的相对浓度较小,产物积累对酶产生竞争性抑制,水解物ACE抑制率降低。当加酶量为4%时,其水解物ACE抑制率与加酶量为3%时相比,并没有显著提高,且水解8h时,两者水解物ACE抑制率相当。综合考虑选择加酶量为3%。
图4 加酶量对水解物ACE抑制率的影响Figure 4 Effect of E∶S on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM
在单因素试验基础上,进一步探讨最佳水解条件,以ACE抑制率为指标判定Flavourzyme对玉米黄粉的酶解效果,选择水解温度、水解液pH、加酶量和底物浓度4个因素,设计L9(34)正交试验。根据单因素试验可知,酶解时间为8h的水解物ACE抑制率最大,所以确定正交试验水解时间定为8h。试验方案及方差分析见表1~3。
由表2可知,Flavourzyme水解玉米黄粉制备ACE抑制肽时,影响水解物ACE抑制率的因素主次顺序为加酶量(D)>底物浓度(C)>pH(A)>温度(B)。最佳组合为A2B1C2D2,即加酶量为3.5% (m/m),底物浓度为6.0%(m/V),水解温度为45℃,pH为6.75。由表3可知,仅加酶量对水解物ACE抑制率影响显著。经验证实验,水解物ACE抑制率为68.16%,可溶性蛋白含量为2.59mg/mL。刘萍等[10]用风味蛋白酶酶解玉米蛋白时,其水解产物ACE抑制率为31.86%。刘志国等[11]分别用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行水解,其水解产物ACE抑制率分别为33.13%、68.36%和45.55%。本研究中得到的水解物ACE抑制率较高。
表1 L9(34)正交试验表Table 1 Factors and levels of orthogonal test L9(34)
表2 L9(34)正交试验结果与分析†Table 2 Result and analysis of orthogonal test(n =3)
玉米黄粉水解液首先通过一个截留分子量为10kDa的超滤膜。水解液的一部分立刻被分开,再将滤液通过一个截留分子量为6kDa的超滤膜,即得到>10kDa,6~10kDa和<6kDa 3个分子量范围的多肽组分,各组分分别冷冻抽干,再配制成一定浓度的蛋白溶液(2.6mg/mL)。各组分蛋白溶液的ACE抑制率见表4。由表4可知,<6kDa组分的ACE抑制率最高,比原水解液增加约20%,且含量占总水解产物的40%左右。此现象说明风味蛋白酶酶解玉米黄粉的水解物中的ACE抑制肽多为小分子量短肽,这与相关报道[1]相符。对水解液进行分级分离,获得ACE抑制率较高的多肽组分,这为进一步分离纯化奠定了基础。
表3 方差分析结果†Table 3 Result of variance analysis
表4 各组分蛋白溶液的ACE抑制率Table 4 ACE inhibitory activity of each fraction/%
以玉米黄粉为原料,经挤压膨化和去淀粉处理后,利用Flavourzyme酶解制备ACE抑制肽,确定最优工艺条件为温度45 ℃,pH 6.75,底 物 浓 度 6.0% (m/V),加 酶 量3.5%(m/m),水解时间8h。在此条件下ACE抑制率为68.16%。水解物经超滤,被分为>10kDa,6~10kDa和<6kDa 3个组分,其中低分子量组分的ACE抑制率明显高于超滤前的玉米黄粉水解液,为88.73%。
本研究发现Flavourzyme水解产物虽然ACE抑制率较高,但水解液中可溶性蛋白含量较低。因此,需要进一步研究以提高蛋白回收率,并开发具有较高ACE抑制活性的低苦味玉米肽产品。随着人们自我保健意识和安全意识的增强,这类药食两用的天然降血压活性肽产品越来越受到人们的青睐,具有广阔的发展前景。
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