乳酸菌高密度培养及浓缩型发酵剂研究

阮雁春

(江苏省扬州商务高等职业学校，江苏 扬州 225127)

作为细菌的一种，乳酸菌能够在乳糖或葡萄糖的发酵过程中生成乳酸，它对促进肠道蠕动、帮助消化具有十分显著的功效。此外，乳酸菌还具有发酵功能，此功能对生产泡菜、乳制品、干酪、发酵香肠等食品十分有帮助。对于这些专用于传统食品的发酵剂研制和生产而言，使用乳酸菌可以实现大规模生产，减少农产品的发酵时间。

发酵剂有体积小、方便运输、操作简单、适应能力强等优点，不需要通过扩大培养这一传统手段就能对发酵制品进行直接生产，在简化生产工艺的同时，还保证了产品质量的稳定性，能够控制菌种发生变质。研制出浓缩发酵剂的重要方式就是通过对乳酸菌采用高活性、高密度培养。高密度培养技术(High Cell Density Culture，HCDC)又称高密度发酵技术，通常是指为了提高菌体发酵密度而使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态的技术。这样既降低了培养规模，又减少了生产时间，不但降低了投资成本，还增强了产品的竞争力。然而菌种不同，其高密度水平有很大差别。［1］

1 影响乳酸菌高密度培养的因素

为了使菌体最终的种群密度最大化，需要对高密度培养过程的各道工序进行合理安排。本实验培养乳酸菌过程中选择的培养基直接影响了乳酸菌的培养方式及生长过程，限制所培养乳酸菌的密度，其影响因素主要是培养基的组成成分、培养基的pH值、培养时所需温度和可能积累的各种代谢产物及副产物等。［2］

1.1 乳酸菌代谢产物

乳酸菌高密度培养过程中需要对代谢产物进行调控。通过分析生长曲线，可以很容易得出反馈抑制作用和代谢产物的积累是阻碍微生物生长的重要原因。三羧酸循环代谢和电子传递链会在高密度培养乳酸菌的过程中生成一些有害的代谢产物。在进行分批培养过程中，也有可能由于细胞密度过高而降低菌体的适应能力。乳酸菌发酵过程中产生的盐类能阻碍细菌的生长，使其生长变慢，阻碍合成代谢副产物中蛋白质的产生。代谢产物的积累抑制了其生长繁殖，对此应该选择有效方法缓解这种抑制作用，以便进行高效生产。

1.2 温度

按乳酸菌生长温度的差异将其分为中温型及高温型两种，其所需最适温度分别为30℃和37℃。条件改变，其生长温度也发生改变。对于乳酸菌来说，不同类型乳酸菌的最适温度范围也存在差异。

大量实验表明，低于37℃乳酸菌是最佳培养温度，这样可以减少营养物的摄入，减缓生长速率。研究人员发现，在25℃ ～42℃内，42℃最适合培养异体蛋白，但也有其他少数蛋白质最佳适应温度是37℃或34℃，甚至更低。

不同的乳酸菌最佳生长温度不同，我们在实验过程中提取制备出乳酸菌，在培养基上进行了温度范围在25℃ ～42℃之间乳酸菌最适温度的实验，其结果如图1所示。从图1中可以看出，乳酸菌适宜在37℃的温度中培养，此温度下可使发酵液中的菌种达到最佳生长速率，增加活菌种群的密度。

图1 温度对乳酸菌培养的影响

1.3 培养基

碳源的差异可以影响乳酸菌的成长。选择由麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等构成的复合糖培养16h，培养后测量活菌数和滴定酸度。试验结论反映，无论何种碳源都会对活菌数及滴定酸度造成显著影响。通过对活菌数量进行对比分析，在培养液中添加含低量葡萄糖的复合碳源，将麦芽糖和乳糖的比例设置为1∶1，此时乳酸的含量最高。添加麦芽糖所生成的乳酸含量较少，会阻碍乳酸菌的生长，所以将乳糖和麦芽糖按比例添加才能够保证正常的pH值环境。

将乳酸菌进行冷冻和干燥发现，若要使菌体细胞膜中的不饱和脂肪酸含量提高，可增加乳酸菌在冻干过程中的存活率，增强乳酸菌中细胞活性。将培养温度调节至低于最适温度10℃，可使乳酸菌细胞内不饱和脂肪酸和不溶性多糖含量增加，同样可以提高菌体的冻干存活率;为了使乳酸菌细胞在冻干过程中大量存活，一般可通过使用诸如NH3·H2O以及Ca(OH)2等碱类物质来进行培养过程中pH值的调节，以此来保证培养基中的酸度不会太高;而为了使乳酸菌菌体在冻干过程中大量存活，一般都会在细胞生长到对数生长末期或者是生长到稳定生长初期进行收获。

1.4 pH值

实验得出，最适合乳酸菌生长繁殖的pH环境为6.5～7.0，乳酸菌在培养液中生长时会生成许多有机酸，当其产生到一定数量时能够阻碍细胞的生长。因此通过控制培养基pH值的变化幅度及提高培养基的缓冲能力会对细胞数目的增加有显著的调节作用。pH值发生变化是由于乳酸菌代谢产物的不同造成的，因此查看pH值的变化也可以作为依据，将其结合，完善高密度培养的发酵过程。在进行自助添加新的培养液的培养方式中，调节pH值的主要方法是连续添加新的培养料，保证其最适的pH值环境，从而达到高密度繁殖的目的。

在对培养基中的pH值进行测定的过程中，首先应将基础培养基的pH值设置到5.5～7.0之间，16h后分别测量起始pH值不同的培养基中活菌的数目。通过实验很容易看出，起始的pH值不能过高或过低，否则会阻碍乳酸菌生长，并且可以知道培养基的最适pH值为6.5，因此可以在试验中适当设置起始pH值，使其处于略高水平，可以有效避免pH值的快速降低。

对实验数据进行处理，我们绘制了pH值对乳酸菌培养的影响曲线，如图2所示，可见不同pH值下乳酸菌的生长速度是不同的，适时调节培养基的pH值可以高效维持乳酸菌健康生长，使pH值保持在6.0－6.5之间效果较为明显。［3］

图2 pH值对乳酸菌培养的影响曲线

2 高密度浓缩乳酸菌的培育方法

浓缩培养的基本原理是:通常采用调节pH值、清除代谢产物以及添加营养物质对乳酸菌进行培养，通过排出代谢产物解决乳酸对细胞生长产生的抑制作用。目前，有以下几种浓缩培养乳酸菌的方法可供选择［4］:

2.1 缓冲盐法

为了最大程度地加快乳酸菌的繁殖和生长，需要找到最适合的生长繁殖酸度，这就要加入缓冲盐制剂，来调节乳酸菌培养液的酸度，使其在一定的范围内发生变化。

2.2 中和法

乳酸菌在生长过程中会产生大量乳酸，为了使乳酸菌大量繁殖，需要使培养液的pH值达到稳定值，通常做法是向培养液中添加一些碱类物质中和。［5］

2.3 膜渗析法

为了使乳酸菌较快繁殖，可以不断地在乳酸菌培养液中添加一些营养物质，此过程产生的各种代谢产物会通过膜除去。中和法以及缓冲盐法的研究及应用极为常见，膜渗析法虽然对相关操作技术以及膜材料的要求很高，但它仍旧是多种浓缩培养乳酸菌方法中较为先进的方式。实验时，为了达到缓冲的效果而利用高浓度的磷酸盐以及蛋白，要使用到质量分数为21% ～28%的脱脂乳和超滤浓缩奶作为培养液;将缓冲盐A加入质量分数为5%脱脂乳水解液培养基中，并且将缓冲盐B加入到质量分数为12%脱脂乳培养基中，在40℃温度环境下培养8h和6h，乳酸菌活菌数分别达到2.2×10mL和6.5×10mL，是不加缓冲盐时的3倍;相关人员在含有质量分数为12%的脱脂乳、质量分数为0.3%酵母膏培养基中，加入质量分数为0.5%的 KHPO盐，设置温度为42℃，维持时间4h，能使活菌数达到2.95×10ml，是起初数目的两倍，然后在溶液中添加含量为30%的 Na2CO3，维持pH值在6.3附近，温度在42℃继续培养6h，能使乳酸菌中的活菌数达到5.89×10ml。由以上试验数据可以看出，当在浓缩培养乳酸菌时使用化学中和法和缓冲盐法具有显著效果，能够使菌体的数量明显增长。［6］

3 培养高密度的乳酸菌广阔发展前景及展望

当前，高密度乳酸菌的研发在国内还是一个新兴的领域，特别是在这种直接使用型发酵剂相对缺少的时候。而作为拥有巨大市场潜力的发酵剂，包括大豆制品、蔬菜肉类及酒类在内的优良直投型发酵剂，更重要的是使用优良发酵剂可使发酵食品的生产成本降低，提高了发酵食品的安全性。［7］乳酸的开发潜力非常巨大，对乳酸菌进行研究时，应该注意以下方面:

第一，对我国历史悠久的传统发酵食品中微生物的作用规律进行分析研究，探索提取制备生长迅速、性能良好稳定、食用安全的乳酸菌新菌种。

第二，应用现代微生物高科技手段，先进膜工程技术和发酵工程技术进行研究，可在制备研究乳酸菌的培养以及发酵剂时，为以后工作提供很好的保障。为了使在单位体积内乳酸菌的活菌含量增加，使得培养高密度乳酸菌的高效技术变得更为重要。

第三，新型的发酵剂制备工艺的研究，对乳酸菌的制备工艺具有深远意义。由于现代生物技术的广大前景，浓缩型发酵剂的制备和乳酸菌的高密度培养等技术在国际上具有非常广阔的市场。只有更加系统全面地学习和研究乳酸菌的遗传学和生理学等方面的知识，才能够生产出优良的乳酸菌制品，走向新时代乳酸菌发酵工业的光明前景。

［1］孟祥晨，等.乳酸菌与乳品发酵剂［M］.北京:科学出版社，2009.

［2］张刚.乳酸细菌:基础、技术和应用［M］.北京:化学工业出版社，2007.

［3］涂展.浓缩型乳酸菌发酵剂的制备［J］.中国乳品工业，2007(5):79－82.

［4］张帅震.发酵乳及新型发酵剂的研究概述［J］.中国奶牛，2009(1):8－10.

［5］强亮生，等.食品添加剂与功能性食品:配方·制备·应用［M］.北京:化学工业出社，2010.

［6］霍贵成.乳酸菌的研究与应用［M］.北京:科学出版社，2009.

［7］郭兴华.益生乳酸细菌:分子生物学及生物技术［M］.北京:科学出版社，2008.