乙型肝炎相关性肝衰竭不同黄疸证的肠道菌群分析

朱文芳，孙克伟，陈 斌，胡 莉，王 轩

（湖南中医药大学第一附属医院传染科，湖南 长沙 410007）

通过对乙型肝炎相关性肝衰竭不同黄疸证型肠道菌群的需氧菌、厌氧菌的定性定量研究，以及血浆内毒素的研究，探讨黄疸不同证型的肠道菌群变化可能存在的阴黄化机制，以及在其并发细菌感染中可能起到的作用。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2011年8月至2012年2月在湖南中医药大学第一附属医院传染科住院治疗的乙型肝炎相关性肝衰竭患者，共30例。符合2006年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组、中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组制定《肝衰竭诊疗指南》中慢加急性（亚急性）肝衰竭的诊断标准［1］。排除标准：（1）急性肝衰竭、亚急性肝衰竭；（2）其他病因（包括其他病毒感染、自身免疫性、药物性、酒精性、中毒性、Wilson病等代谢性疾病）导致的肝衰竭；（3）在慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化基础上重叠感染甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）、丙型肝炎病毒（HCV）及丁型肝炎病毒（HDV）感染所致慢加急性（亚急性）肝衰竭者；（4）合并原发性胆汁性肝硬化（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）、结石、肿瘤等肝外梗阻性黄疸；（5）合并原发性肝癌或其他肿瘤患者；（6）妊娠或哺乳期妇女；（7）服用免疫抑制剂的患者。 按中医“黄疸”辨证［2-3］：其中阳黄患者 15 例，证属湿热蕴结型；男 11 例，女 4 例；年龄（40±12.3）岁；而临床无法按阴、阳黄辨证的一类患者，即非阳非阴黄（阴阳黄）患者15例，证属脾虚兼湿热型；男13例，女 2 例；年龄（42±11.2）岁。 健康组 10 例，来源于湖南中医药大学在校学生、教职工，男6例，女4例，年龄（38±13.1）岁。三组在年龄、性别方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 大便检测 取晨起粪便标本收集于无菌杯，0.5 h内接种；称量第1支已含有9 mL的稀释液的管G1，取黄豆大小标本放置于其中称重G2。标本重G=G2-G1；振荡器上充分震荡，用1 mL枪吸1 mL于第2管，然后逐次进行倍比稀释；取10-7和10-5各50μL，分别添加于肠球菌培养基(EC培养基 自制)、肠杆菌培养基(中国蓝培养基 青岛)、乳酸杆菌培养基(LBS培养基 青岛)、双歧杆菌培养基(BLb琼脂培养基 青岛)、拟杆菌培养基(KVB培养基 青岛)平板。L棒涂匀，从低浓度向高浓度，依次涂匀。将厌氧菌(乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌)置于厌氧箱中，并需氧菌（肠球菌、肠杆菌）一起置于37℃恒温细菌培养箱。24 h后鉴定需氧菌，72 h后鉴定厌氧菌。菌种鉴定：厌氧菌三级鉴定法，采用API生物化学鉴定系统，将细菌鉴定到属水平，检测下限为每克湿便2×10 cfu，对数换算后即为表1。

1.2.2 内毒素检测 采用鲎试剂基质显色法检测，显色基质鲎试剂盒由厦门鲎试剂实验厂有限公司提供。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3组间肠道菌群比较

阳黄组与健康组比较肠道菌群变化表现为肠球菌、肠杆菌的显著增多(P＜0.05，P＜0.01)，双歧杆菌、乳酸杆菌等厌氧菌有减少的趋势。说明阳黄组的肠道细菌在数量上偏离了正常的生理组合，提示乙型肝炎相关性肝衰竭阳黄证存在菌群失调，菌群失调以需氧菌的增多为主。阴阳黄组与健康组比较肠道菌群发生的变化更为明显：肠球菌进一步显著增多(P＜0.01)，而肠杆菌与健康人比较稍有增加，但无统计学意义（P＞0.05）；双歧杆菌明显减少(P＜0.01)，乳酸杆菌亦减少（P＜0.05），类杆菌无明显变化。说明阴阳黄/阴黄组的肠道细菌在数量上偏离了正常的生理组合，提示乙型肝炎相关性肝衰竭阴阳黄证存在菌群失调，菌群失调以双歧杆菌、乳酸杆菌等厌氧菌的减少为主，伴有肠球菌的增多。阴阳黄组与阳黄组比较肠球菌显著增多（P＜0.01），而肠杆菌的数量反而减少 （P＜0.05），双歧杆菌进一步减少（P＜0.05），乳酸杆菌有下降的趋势，但无统计学意义。见表1。

表1 健康组、阳黄组和阴阳黄组湿便中肠道菌群的比较 ，LgN，CFU/g）

表1 健康组、阳黄组和阴阳黄组湿便中肠道菌群的比较 ，LgN，CFU/g）

注：与健康组比 *P＜0.05，**P＜0.01；与阳黄组比 #P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 血浆内毒素检测结果

乙型肝炎相关性肝衰竭患者与健康人比较，血浆内毒素水平均显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，并且阴阳黄组血浆内毒素水平较阳黄组升高（P＜0.01）。见表2。

表2 健康组、阳黄组和阴阳黄组的血浆内毒素比较 s，EU/mL）

表2 健康组、阳黄组和阴阳黄组的血浆内毒素比较 s，EU/mL）

注：与健康组比较 #P＜0.05，##P＜0.01；与阳黄组比较 *P＜0.01。

组 别健康组阳黄组阴阳黄组n 10 15 15内毒素0.031±0.012 0.048±0.018#0.141±0.051##*

3 讨论

肠道微生态由三个部分组成：肠道菌群、肠上皮细胞、肠道黏膜免疫系统［4］。其中寄居在肠道中为数众多的肠道菌群既具有对外来菌抗定植作用，也与肠黏膜的屏障和免疫功能有密切关系。近年来，由于对肠－肝轴认识的逐步深入，肠道菌群在慢性肝病发病过程中的作用备受关注［5］。研究报道，慢性肝病尤其是慢性重型肝炎患者存在严重肠道微生态改变，双歧杆菌、类杆菌数量显著减少，肠杆菌、酵母菌数量显著增加。肠道菌群紊乱时，肠黏膜细胞之间紧密连接下降、通透性增高，使肠黏膜的屏障功能减弱，造成大量肠源性内毒素易位进入门脉系统，同时慢性肝病时肝脏库普弗细胞的代谢和清除内毒素的能力下降，从而导致血浆内毒素水平的增高，加重了肝脏的打击。

本研究利用传统大便培养方法，对5种肠道优势菌肠球菌、肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌进行培养研究。发现乙型肝炎相关性肝衰竭患者中医辨证中不同的黄疸证患者的肠道菌群有不同的特点。与健康人相比较，以“湿热”为主的阳黄证肠道菌群失调表现为肠球菌、肠杆菌的显著增多 (P＜0.05，P＜0.01)，即以需氧菌的增多为主要表现，这一特点与近年来对脾胃湿热证的肠道菌群研究结论相吻合。江月斐［6］等研究表明脾胃湿热证组细菌密度及比例上明显高于脾虚组，包括许多革兰阳性菌与革兰阴性菌的感染以及HP感染，这在一定程度上说明了脾胃湿热证存在明显的炎症和感染。因此菌群失调以肠球菌、肠杆菌显著增多的阳黄证患者正处于激烈的“正邪相争”状态［7］。以脾虚为主的阴阳黄证肠道菌群失调表现为肠球菌的进一步显著增多(P＜0.01)，而肠杆菌与阳黄证比较反而减少 （P＜0.05）；双歧杆菌、乳酸杆菌的减少。专性厌氧菌（益生菌）的减少提示此时期机体的免疫功能的急剧下降，肠道菌群严重失调。回顾阴阳黄患者的临床用药情况，有着长期抗生素的用药史，经验告诉我们肝病患者主要以G-杆菌的过度生长引起感染，因此，临床上常首选对革兰氏阴性菌敏感的第三代头孢菌素进行预防或治疗，因而导致了本研究肠杆菌反而减少，使得原本致病力很低的肠球菌感染增多，甚至合并真菌的感染。这一结论与王晓东［8-9］等发现肠球菌是重型肝炎患者感染的重要条件致病菌的临床结论相符。因此对于阴阳黄患者，临床中我们更应关注由于肠道菌群失调导致的细菌移位而引起的继发感染、二重感染。

从中医学五脏学说来讲，小肠和大肠的功能是“脾主运化”、“胃主受纳”中的一部分，肠泌别清浊和传化糟粕的作用是脾气升清、胃气降浊作用的进一步延伸。脾胃虚弱或功能受损，即可引起肠道泌别清浊和传化糟粕功能的异常，进而引起肠道功能障碍。因此肠道菌群失调、肠道屏障功能障碍，就脏腑而言主要涉及脾胃，是脾虚证的病理生理表现。乙型肝炎相关性肝衰竭患者由于肝脏功能下降、胃排空延迟、肠道长期瘀血等诸多病理改变，临床上除黄疸不退外，最常见的临床表现为乏力、纳差、食后腹胀加重、大便溏等脾虚证候，且脾虚证候贯穿之始终。随着脾虚症状的加重，“阳黄-阴阳黄-阴黄”过程中，双歧杆菌亦逐步显著减少，肠道菌群失调的程度也愈来愈明显，血浆内毒素水平逐步增高，进一步说明了“脾虚”是阴黄化机制的病理生理基础。

鉴于客观条件限制，本研究纳入病例数不多，样本量小。典型阴黄证的病例收集过少，脾肾阳虚状态之阴黄证与肠道菌群、内毒素的之间关系，有待进一步深入研究。由于临床治疗的需要，虽本实验结果并不能代表乙型肝炎相关性肝衰竭患者肠道菌群的自然演变过程，但鉴于此类病人在临床治疗时抗生素应用的重要性及广泛性，故仍具有一定的临床指导意义。

[1]中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组.肝衰竭诊疗指南[J].中华肝脏病杂志，2006（14）：643-646.

[2] 田德禄.中医内科学[M].北京：人民卫生出版社，2002：237.

[3] 王永炎.中医内科学[M].上海：上海科技出版社，1994：210.

[4]顾玉荣，高志良.肝脏疾病的肠道微生态失衡及其对机体的影响[J].热带医学杂志，2010，10(3)：359-360.

[5]Fowler JC，Zecchini VR，Jones PH.Intestinal activation of notch signaling induces rapid onset hepatic steatosis and insulin resistance[J].Plos One，2011（6）：20767.

[6]江月斐，劳绍贤，旷枣园，等.腹泻型肠易激综合征脾胃湿热证肠道菌群的变化[J].中国中西医结合杂志，2006，26(3)：218-220.

[7]林 敏.脾胃湿热证研究进展.光明中医，2011，26(12)：2 587-2 590.

[8]王晓东，姜开庆，朱碧红，等.重型肝炎患者肠球菌感染及体外药敏监测[J].中华肝脏病杂志，2006，14(5)：376-377.

[9]李 明，董训兰.130株临床肠球菌属感染特点及耐药性分析[J].中华医院感染会杂志，2007，17(7)：885-887.