白介素18基因启动子区－137G/C单核苷酸多态性与颅内动脉瘤发病和破裂的关系研究

陈 广，李云超，邱 虹，于向东，邵德明

颅内动脉瘤 (IAs)是一种致死率高、致残率高的脑血管疾病，病因和发病机制至今尚未完全明了。本研究旨在通过病例－对照研究的方法，运用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性 (PCR－RFLP)及DNA直接测序检测我院和唐山市工人医院收治的195例IAs患者的白介素 (IL) －18基因启动子区－137G/C单核苷酸多态性 (SNP)位点的基因型频率和等位基因频率，探索IL－18基因多态性与IAs发病、破裂的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年3月—2009年10月在河北联合大学附属开滦总医院和唐山市工人医院神经外科住院治疗的IAs患者98例 (动脉瘤组)，均为唐山地区汉族人;其中男47例，女51例;年龄30～70岁;均通过全脑血管造影 (双侧椎动脉、双侧颈内动脉、双侧颈外动脉)确诊为颅内囊性动脉瘤;均无IAs及蛛网膜下腔出血 (SAH)家族史，并且排除常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)、Ehlers－Danlos综合征Ⅳ型和马凡综合征。将动脉瘤组进一步分为破裂组62例和未破裂组36例;破裂引起的SAH经颅脑CT或腰椎穿刺证实，破裂组均为初发SAH。因自发性SAH入院，但经数字减影血管造影 (DSA)检查未发现IAs的患者，或确诊为脑血管畸形、动静脉瘘、烟雾病患者，未列入本研究。另选取同期住院治疗的非脑血管疾病患者97例 (对照组)，其中男53例，女44例;年龄33～72岁;均经颅脑MRA、螺旋CT血管成像(CTA)或DSA检查排除IAs。动脉瘤组和对照组均无卒中病史、无IAs及SAH家族史、无遗传性结缔组织病史，病例彼此间无亲缘关系。动脉瘤组与对照组患者的性别、年龄、既往史 (高血压史、糖尿病史、冠心病史)、个人史 (吸烟史、饮酒史)比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1)，两组患者基线标准齐平，具有可比性。

表1 两组临床资料比较Table 1 Comparison of clinical information between two groups

1.2 方法 提取195例患者的外周血基因组 DNA，采用 PCR－RFLP及DNA直接测序的方法检测IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点的基因型频率和等位基因频率。

1.3 统计学方法 资料录入采用Excel软件建立数据库，并进行双遍录入及核查，应用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料以 (±s)表示，组间比较采用成组t检验;计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL－18基因启动子区－137G/C SNP与IAs的关系 标本均成功扩增出目的片段。在琼脂糖凝胶电泳实验中均能观察到对应于相应标记物标记位置的片段。PCR扩增产物为259 bp片段 (见图1)。

图1 IL－18基因启动子区－137G/C电泳的PCR产物Figure 1 PCR products of electrophoresis of the IL－18 gene－137G/C

2.2 动脉瘤组和对照组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点的测序结果 经DNA直接测序发现3种基因型:野生型纯合子GG，杂合子GC，突变型纯合子CC。测序结果见图2。

图2 IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点的测序结果Figure 2 Sequencing result of genotypes in IL－18－137G/C SNP

2.3 动脉癌组和对照组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点多态性分布 动脉瘤组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点基因型及等位基因分布与对照组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)，其中基因型以GG型最多，其次为GC和CC型，等位基因以G多见;动脉瘤组G等位基因的频率与对照组比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

表2 动脉瘤组与对照组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点的多态性分布〔n(%)〕Table 2 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in IAs patients and controls

2.4 IAs患者破裂组与未破裂组 IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点多态性分布 破裂组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点基因型及等位基因分布与未破裂组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)，其中基因型以GG型多见，其次为CC和GC型，等位基因以G型多见;破裂组G等位基因的频率与未破裂组比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

表3 IAs患者破裂组与未破裂组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点的多态性分布〔n(%)〕Table 3 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in ruptured and non－ruptured IAs patients

3 讨论

IAs的相关致病基因逐渐被人们所重视，并进行了深入研究，不少学者认为IAs是一种由多种环境因素和多个基因共同作用的多基因疾病［1－2］。分子生物学研究表明，IL－18基因存在基因变异及多态性，其多态性可影响IL－18转录和翻译，进而影响IL－18相关的炎性疾病的发生、发展和转归［3］。目前对IL－18基因多态性的研究主要是针对过敏性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤及损伤后脓毒症等疾病，研究表明IL－18与这些疾病的发生有一定关系。少数研究对IL－18基因多态性与心血管疾病的关系进行了研究。周超等［4］报道IL－18基因启动子区－137位点多态性与儿童结核病易患性有关，－137位点等位基因G可影响IL－18蛋白表达，可能是结核病的易患基因。Imboden等［5］报道IL－18基因启动子区－137位点等位基因G是过敏性哮喘的遗传危险因素。

越来越多的证据表明，IL－18基因多态性诱导炎症反应在IAs的发生、发展和破裂的过程中扮演着重要角色。IL－18基因多态性通过诱导炎性反应可以引起白细胞黏附于血管壁，淋巴细胞免疫应答，炎性细胞因子〔IL、肿瘤坏死因子(TNF)等〕、基质金属蛋白酶 (MMP)和其他蛋白溶解酶释放，引起血管壁的血管内皮损伤、胶原蛋白减少、细胞外基质降解和重构，并导致血管壁的脆性增加，继而与其他因素一起导致动脉瘤的发生。Chyatte等［6］为了明确炎症或免疫反应与IAs的关系，在显微外科手术中收集了25例患者的动脉瘤组织 (前交通动脉瘤10例、大脑中动脉瘤9例、颈内动脉瘤5例、基底动脉瘤1例)，其中23例未破裂，2例已破裂，动脉瘤直径 (9.2±4.9)mm;另外从死亡24 h内的尸检中收集11例基底动脉组织作为对照，两组间无年龄、性别差异。采用免疫组织化学法对动脉瘤组织研究 (因为部分标本体积太小而无法染色，各组的标本数不同)发现，巨噬细胞和单核细胞(CD68)在近一半 (10/22)的动脉瘤全层阳性，其中6例为弥漫性、4例为局限性浸润，T淋巴细胞 (CD3)近一半 (6/13)为阳性，而以上细胞在对照组全部 (11例)为阴性;B淋巴细胞 (CD20)在一小部分 (3/19)中为阳性，而对照组也均为阴性;所有动脉瘤标本 (19/19)瘤壁全层补体C3c均为阳性，其中9/19的标本呈弥漫性阳性，而在对照组仅3/11在管腔一侧为小片状阳性;补体C9在绝大部分动脉瘤中(18/19)全层阳性，其中15/19为弥漫性阳性，而对照组3/9为弥漫性阳性，3/9为小片状阳性且位于管腔侧;半数以上的(12/17)免疫球蛋白IgG阳性，其中5/17为弥漫性阳性，而对照组中仅1/9为弥漫性阳性;IgM也有类似的表现;血管细胞黏附分子－1在大多数动脉瘤全层中 (11/14)为阳性，且除1例为局部阳性外，其他均为弥漫性阳性，而在对照组5/7仅在内膜和外膜为阳性，却无一例全层阳性。以上各种成分可同时存在，但并非绝对。以上发现提示动脉瘤壁存在炎症反应或免疫反应。另外，Kataoka等［7］研究发现在破裂和未破裂的IAs局部均有大量的巨噬细胞和白细胞侵润，不仅在破裂的动脉瘤局部存在一定的炎症反应和免疫反应，而且在未破裂的动脉瘤局部及周围同样存在一定的炎症反应和免疫反应，提示炎症反应并非动脉瘤破裂所继发，而是贯穿于IAs的发生、发展和破裂的全过程。

目前国内外对炎性基因SNP与动脉瘤关系的研究已成为热点，目前已有报道的基因包括:IL－1β基因、IL－6基因、TNF－α基因等。Morgan等［8］研究发现，IL－6基因启动子区－174G＞C和－572G＞C多态性与动脉瘤发生相关，并对91例高加索动脉瘤患者进行了基因型的测定，与正常人对照后发现，两组之间在等位基因频率和基因型上存在显著差别。动脉瘤组中－572位点上出现C等位基因的频率以及出现C纯合子基因型的频率显著高于对照组;而在－174位点上，对照组出现C纯合子基因型的频率显著高于动脉瘤组。Yamada等［9］在日本人群中证实，TNF基因启动子－863位点等位基因A和基因型AA与动脉瘤相关。动脉瘤患者中G等位基因和GG基因型频率均显著高于正常对照人群。我们认为，虽然不同种族的动脉瘤患者优势等位基因不同，但这些优势等位基因必然通过相同的信号转导途径导致动脉瘤的发生。

本研究结果显示，对照组IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点G、C等位基因频率分别为80.4%、19.6%，与国内其他报道中 IL－18基因启动子区 －137G/C SNP位点 G(82%)、C(18%)等位基因频率相一致。IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点各基因型和等位基因频率在动脉瘤组与对照组之间、破裂组与未破裂组之间均有差异，说明IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点可能在IAs的发病和破裂过程中起主要作用。与对照组比较，IAs患者IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点G等位基因频率和GG基因型频率高，而破裂组与未破裂组比较，IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点G等位基因频率和GG基因型频率更高。说明IL－18基因启动子区－137G/C SNP位点G等位基因可能通过如下机制促进IL－18的转录和翻译: －137G/C SNP位点位于IL－18基因转录起始点上游的启动子区，由G变为C改变核因子H4TF－1的结合位点，并由此阻断受H4TF－1调控的基因转录，使IL－18表达水平增加，并诱导γ干扰素 (IFN－γ)的生成和激活，IL－18通过核因子κB途径促进炎性递质及黏附分子基因的转录合成，它还可以诱导趋化因子和其他多种细胞因子的表达，从而发挥致炎效应。

综上所述，由于破裂动脉瘤的预后不良，故对于未破裂的动脉瘤而言，发现动脉瘤壁广泛存在的炎症反应和免疫反应有着重要的临床价值。所以基因多态性与动脉瘤壁炎症反应和免疫反应研究尤为重要。随着对炎症和动脉瘤关系的进一步了解，基因多态性的特异性抗炎治疗将有助于防止IAs的发生和破裂。

1 Lindgaard L，Eskesen V，Gjerris F，et al.Familial aggregation of intracranial aneurysms in an Inuit patient population in Kalaallit Nunaat(Greenland) ［J］.Neurosurgery，2003，52(2):357－363.

2 邱虹，李云超，陈广，等.白介素18基因启动子区－607C/A多态性与颅内动脉瘤的发病和破裂的关系［J］.中国全科医学，2012，15(9):3135.

3 Pawlik A，Kurzawski M，Drozdzik M，et al.Interleukin－18 gene(IL18)promoter polymorphisms in patients with rheumatoid arthritis［J］.Scand J Rheumatol，2009，38(3):159 －165.

4 周超，蒋利萍，王春燕，等.重庆汉族儿童IL－18基因启动子－137G/C多态性及蛋白表达与结核病易感性的关系［J］.重庆医科大学学报，2008，33(9):1029－1033.

5 Imboden M，Nicod L，Nieters A，et al.The common G －allele of interleukin－18 single－nucleotide polymorphism is a genetic risk factor for atopic asthma.The SAPALDIA Cohort Study ［J］.Clin Exp Allergy，2006，36(2):211－218.

6 Chyatte D，Bruno G，Desai S，et al.Inflammation and intracranial aneurysms［J］.Neurosurgery，1999，45(5):1137－1147.

7 Kataoka K，Taneda M，Asai T，et al.Structural fragility and inflammatory response of ruptured cerebral aneurysms.A comparative study between ruptured and unruptured cerebral aneurysms［J］.Stroke，1999，30(7):1396－1401.

8 Morgan L，Cooper J，Montgomery H，et al.The interleukin －6 gene－174G＞C and－572G＞C promoter polymorphisms are related to cerebral aneurysms［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(8):915－917.

9 Yamada Y，Metoki N，Yoshida H，et al.Genetic risk for ischemic and hemorrhagic stroke ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(8):1920－1925.