两种荧光定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织中微小RNA－21的应用分析

张晟春，王 燕，张兴毅，王才友

目前微小RNA(microRNA，miR)在疾病中起的重要作用越来越来受到人们的重视，有报道显示乳腺癌和miR－21相关［1］，miR－21在乳腺癌中可能具有疾病诊断与预后判定的潜在价值，还可能是有效的治疗靶点，miR－21在乳腺癌中表达增高并与肿瘤的浸润与转移相关。荧光定量聚合酶链反应(FQ－PCR)技术作为检测基因表达的最简便和易行的手段，在科研和临床上都已得到普遍的应用。通常使用的标记物有SYBR GreenⅠ染料和TaqMan探针，本研究建立两种检测模式，检测miR－21在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达，并进行比较，选择临床更适用的检测方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2010年度遵义医学院附属医院普外科住院的手术治疗的乳腺癌患者14例，均为女性;平均年龄47.3岁。均经病理证实为乳腺癌，其中浸润性导管癌11例，乳腺小管癌1例，原位癌1例，黏液癌1例。手术切除的乳腺组织标本，包括乳腺癌组织和癌旁组织 (距肿瘤边缘＞5 cm)14对。实验室编号为1～28号，其中单号为癌旁组织，双号为与单号配对的乳腺癌组织。术中标本移出体外后立即切取1 cm×1 cm迅速置于液氮中冷冻，－80℃保存备用，其余送病理科做病理检查。

1.2 主要试剂 TRIzol试剂，cDNA合成试剂盒，无RNA酶的糖原购于invitrogen公司;U6寡核苷酸探针，TaqMan探针法PCR试剂，Taq酶及配套试剂购于上海生物工程有限公司;SYBR GreenⅠ染料法定量PCR试剂购于ABI公司;其他未列出的各种化学试剂均为Sigma公司产品或国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌组织和癌旁组织RNA提取 从－80℃低温冰箱取出标本后迅速移至冰上，切取50～100 mg组织，置1.5 ml离心管中，加入1 ml Trizol然后使用电动匀浆机以3 500 r/min(离心半径3 cm)的速度对组织进行快速匀浆，40 s，室温静置5 min。加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，静置3 min。4℃离心，12 000 r/min×10 min(离心半径8 cm)，取上清。加入0.5 ml异丙醇，－20℃沉淀20 min。4℃离心，12 000 r/min×10 min(离心半径8 cm)，弃上清。加入1 ml 75%乙醇轻轻洗涤RNA沉淀斑块后加入适量的Rnase－free H2O溶解。

1.3.2 提取总RNA纯度鉴定 采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察总RNA的5 S rRNA、18 S rRNA和28 S rRNA条带情况，RNA条带完整，5 S rRNA的条带较弱，28 S rRNA的亮度约为18 S rRNA的 2倍，OD260/OD280比值1.8～2.0，说明RNA纯度较高，可为后续实验所用。

1.3.3 cDNA第一链合成 在0.2 ml PCR管中加入以下试剂:Total RNA，5.0 μl; 特异性引物+U6R引物，1.0 μl;Rnasefree ddH2O，5.0 μl;70℃温浴5 min。冰浴10 s，离心加入下列试剂:5 ×Reaction Buffer，4.0 μl;dNTP Mix(10 mmol/L)，2.0 μl;Rnase inhibitor(20 U/μl)，1.0 μl;AMV Reverse Transcriptase(10 U/μl)，2.0 μl。Total volume，20.0 μl。37℃温浴5 min。42℃温浴60 min。70℃温浴10 min，终止反应。将上述溶液－20℃保存，备用。

1.3.4 引物、探针序列的设计与合成 根据miR－21和U6基因相应的全基因序列，应用PrimerPremie:5.0软件进行引物、探针设计。内参基因 U6，F Primer:5'－CTGCTTCGGCAGCACA－3';R Primer:5'－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3';Probe:CCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCA目的基因miR－21，特异性反转录引物miR－21 RT:5'－CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATCAG－3';F Primer:5'－ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTG－3';R Primer:5'－TGGTGTCGTGGAGTCG－3';Probe:CAATTCAGTTGAGTCAACATCAGTC。

1.4 Real－Time PCR反应

1.4.1 SYBR GreenⅠ染料法 总反应体积为 20 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix，10 μl;F Primer(10 μmol/L)，1 μl;R Primer(10 μmol/L)，1 μl;ddH2O，7 μl;Template(cDNA)，1 μl。冰浴中充分混匀扩增反应条件:95℃ 10 min变性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。扩增完后，进行熔解曲线分析60℃2 min，以0.1℃/s的速率升温，直到95℃;整个过程进行连续采集荧光，获得其扩增曲线和熔解曲线并分析后的CT值。

1.4.2 TaqMan探针法 总反应体积为 25 μl，2×HS PCR Master Mix，12.5 μl;F Primer(10 μmol/L)，0.5 μl;R Primer(10 μmol/L)，0.5 μl;Probe(10 μmol/L)，0.5 μl;ddH2O，9 μl;Template(cDNA)，2 μl。冰浴中充分混匀。扩增反应条件:95℃ 2 min变性，95℃ 10 s，60℃ 60 s，40个循环。

1.5 Northern Blot试验

1.5.1 变性PAGE电泳 1×TBE，25 W预跑 (1 h)。15 μl样品立即冰浴5 min，加入加样孔。在5 W电压下，电泳30 min，再用10 W电压电泳约80 min。

1.5.2 转膜、交联 0.5×TBE中，充分湿润尼龙膜及厚滤纸2张。平铺在半干转膜仪上，盖上转印槽，加入稳定电流0.8 mA/cm2，60 min;转膜后用2×SSC冲洗膜2次。将膜放在紫外线交联仪中 (85 000 μJ/cm2)，并用两层干净滤纸把膜包在中间，然后再用干胶仪抽真空干烤 (80℃)2 h。

1.5.3 预杂交、标记及杂交 尼龙膜用2×SSC的润湿，后把膜放入杂交瓶，预热预杂交/杂交液37℃，10 min以上，准备鲑精DNA，95～100℃，5 min，然后冰上15 min。每ml预杂交/杂交液加入10 μl(100 μg) 鲑精DNA。在杂交管中加入事先预热的预杂交/杂交液及鲑精，放于杂交炉中，37℃以最慢转速转2 h～ON(over night)。

1.5.4 探针制备 探针制备参见引物序列的设计与合成部分，反应体系为20 μl混合物，反应条件:37℃孵育1 h，70℃灭活15 min;把探针加入到变性的鲑精DNA中，混合均匀后放入杂交炉，37℃，24 h～ON。

1.5.5 洗膜、放射自显影及探针的去除/洗脱 加入2×SSC，洗去残留同位素。用镊子取出膜，用保鲜膜包膜磷屏中曝光。用严谨洗脱液 (0.1%SDS，0.1×SSC)洗1～3次。方法:杂交炉内85～90℃，旋转40 min。

1.6 统计学方法 使用MX－3000P软件收集整个PCR过程中的荧光，采用相对定量法，分析乳腺癌细胞内miR－21基因相对于U6内参基因的表达变化，所有样本的检测均平行重复3次，PCR扩增后，采集对应的CT值，得到乳腺癌组织和癌旁组织的Mean CT值和△CT值。应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析，计量资料以 (±s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA抽提质量鉴定结果 提取的Total RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。凝胶电泳图从左到右依次为1～28号样本 (见图1)。

图1 Total RNA 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性Figure 1 AGE of total RNA

2.2 PCR扩增结果

2.2.1 扩增曲线结果 扩增曲线显示SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法扩增的U6及miR－21的扩增曲线符合PCR扩增规律，表明其结果可靠 (见图2～5)。

图2 SYBR GreenⅠ染料法的U6扩增曲线Figure 2 U6 amplification curve of SYBR GreenⅠdye method

2.2.2 熔解曲线结果 U6熔解温度为82.1℃ (见图6)，MiR－21熔解温度为80.6℃ (见图7)。

2.3 乳腺癌组织与癌旁组织miR－21表达结果 SYBR GreenⅠ染料法检测乳腺癌组织与癌旁组织中miR－21的表达，差异有统计学意义 (t=6.704，P=0.000，见表1);TaqMan探针法检测乳腺癌组织与癌旁组织中miR－21的表达，差异有统计学意义 (t=7.238，P=0.000，见表2)。SYBR GreenⅠ染料法与TaqMan探针法检测乳腺癌组织中miR－21表达，差异无统计学意义 (t=2.33，P=0.053);SYBR GreenⅠ染料法与TaqMan探针法检测乳腺癌旁组中miR－21表达，差异无统计学意义 (t=0.07，P=0.95)。

图3 TaqMan探针法的U6扩增曲线Figure 3 U6 amplification curve of TaqMan probe method

图4 SYBR GreenⅠ染料法的miR－21扩增曲线Figure 4 miR－21 amplification curve of SYBR GreenⅠdye method

表1 SYBR GreenⅠ染料法检测U6及miR－21表达的比较 (±s)Table 1 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by SYBR GreenⅠdye method

表1 SYBR GreenⅠ染料法检测U6及miR－21表达的比较 (±s)Table 1 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by SYBR GreenⅠdye method

注:△CT值为miR－21 Mean CT减去U6 Mean CT

癌旁组织实验编号 U6 Mean CT miR－21Mean CT △CT 1 10.56±0.12 22.01±0.14 11.45 2 15.21±0.06 22 CT乳腺癌组织实验编号 U6 Mean CT miR－21Mean CT △7.05±0.11 4.36.00±0.11 6.79 3 10.52±0.36 20.56±0.17 10.04 4 24.12±0.15 25.61±0.13 1.49 5 11.32±0.21 19.54±0.24 8.22 6 10.37±0.38 15.32±0.21 4.95 7 13.43±0.10 21.82±0.11 8.39 8 14.21±0.16 18.87±0.10 4.66 9 11.23±0.20 20.54±0.16 9.31 10 10.01±0.11 15.60±0.20 5.59 11 12.31±0.08 19.20±0.11 6.89 12 10.79±0.07 14.75±0.10 3.96 13 13.66±0.14 21.93±0.19 8.27 14 14.54±0.14 22.65±0.13 8.11 15 17.38±0.10 25.47±0.31 8.09 16 23.89±0.15 24.01±0.21 0.12 17 14.56±0.10 22.96±0.20 8.40 18 10.22±0.06 15.29±0.17 5.07 19 13.46±0.16 20.34±0.10 6.88 20 12.64±0.17 17.49±0.04 4.85 21 15.03±0.06 24.27±0.06 9.24 22 14.26±0.17 16.53±0.07 2.27 23 17.40±0.10 25.56±0.34 8.16 24 11.27±0.22 17.39±0.09 6.12 25 14.93±0.08 23.78±0.14 8.85 26 15.32±0.09 18.47±0.10 3.15 27 13.29±0.11 21.88±0.10 8.59 28 12.69±0.06 1

表2 TaqMan探针法检测U6及miR－21表达的比较 (±s)Table 2 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by TaqMan probe method

表2 TaqMan探针法检测U6及miR－21表达的比较 (±s)Table 2 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by TaqMan probe method

注:△CT值为miR－21 Mean CT值减去U6 Mean CT

癌旁组织实验编号 U6 Mean CT miR－21Mean CT △CT 1 10.24±0.17 21.87±0.05 11.63 2 14.84±0.18 22 CT乳腺癌组织实验编号 U6 Mean CT miR－21Mean CT △7.34±0.15 4.80.41±0.01 7.57 3 9.95±0.02 19.77±0.12 9.82 4 20.27±0.11 23.77±0.13 3.50 5 11.09±0.09 19.11±0.08 8.02 6 10.01±0.15 15.17±0.03 5.16 7 12.51±0.10 22.13±0.03 9.62 8 13.94±0.12 18.43±0.09 4.49 9 11.54±0.13 20.96±0.07 9.42 10 9.75±0.24 15.46±0.06 5.71 11 13.12±0.21 20.22±0.13 7.10 12 10.12±0.27 14.31±0.17 4.19 13 12.91±0.16 21.42±0.05 8.51 14 15.21±0.12 23.01±0.16 7.80 15 17.07±0.10 24.88±0.11 7.81 16 24.80±0.14 24.86±0.27 0.06 17 14.00±0.09 23.00±0.14 9.00 18 9.30±0.13 14.81±0.09 5.51 19 12.68±0.19 20.23±0.02 7.55 20 11.35±0.16 17.15±0.02 5.80 21 14.60±0.08 22.42±0.16 7.82 22 14.02±0.03 16.16±0.02 2.14 23 16.91±0.11 24.61±0.47 7.70 24 10.92±0.22 17.33±0.10 6.41 25 14.56±0.46 23.18±0.09 8.62 26 14.12±0.10 17.65±0.11 3.53 27 12.28±0.07 20.59±0.17 8.31 28 12.54±0.05 1

图5 TaqMan探针法的miR－21扩增曲线Figure 5 miR－21 amplification curve of TaqMan probe method

2.4 Northern Blot检测miR－21在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况 Northern Blot检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR－21的表达，探针分别为miR－21和U6的反义链，由32P标记。用Image Quant软件测定灰度值评定信号表达强弱，结果表明，乳腺癌组织中miR－21高表达，而癌旁组织中miR－21低表达 (见图8、9)。

3 讨论

因miR在不同物种和组织中表达水平上有很大的差异，能准确、灵敏地检测出miR在相应组织器官中的含量就变得非常重要，并且miR是一类很小的同源分子，部分小RNA的表达水平可能很低，因此需要极为灵敏而定量的检测方法。基于miR在各方面的重要作用，迫切需要一种简单、快捷，低成本的检测方法用于临床检验。

图6 U6的熔解曲线Figure 6 U6 melting curve

图7 miR－21熔解曲线Figure 7 miR－21 melting curve

图8 Northern Blot显示miR－21在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况Figure 8 Expression of miR－21 in breast cancer and surrounding tissues showed by Northern Blot

图9 Northern Blot显示miR－21在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况的相对灰度值Figure 9 Relative gray value of miR－21 in breast cancer and surrounding tissues showed by Northern Blot

目前已经发展了多种有效的miR－21检测方法:(1)克隆测序:用于发现新的miR－21的首选方法。(2)芯片技术:可以实现快速、高通量的检测。但是基因芯片检测方法的信息质量的稳定性和可重复性比较差，对获得的结果通常需要采用Northern Blot和实时FQ－PCR方法进行验证。 (3)Northern Blot:是验证和确认miR的重要方法，但该方法繁琐灵敏度较低并且时间较长，不适合用于高通量检测。 (4)实时FQ－PCR可以精确地定量分析miR的表达，常用的有茎一环的RT－PCR方法 (stem－loop RT－PCR)和poly A加尾的RT－PCR方法［2］。实时FQ－PCR方法具有检测范围宽、灵敏性高、精确度高、产出率高、可以进行多重检测的优点。从原理上讲有2大类荧光模式:第1种为荧光杂交探针，如Taq-Man等。第2种为 DNA结合染料，如 SYBR GreenⅠ等。SYBR GreenⅠ实时FQ－PCR法，引物设计较简单且只需合成序列特异引物，成本相对较低，使用方便等优点而被广泛应用［3－5］，但是相对而言特异性较差，易受引物二聚体的影响。通过优化反应体系和荧光捕获点，运用熔解曲线和凝胶电泳可证实其特异性，SYBR GreenⅠ实时FQ－PCR检测方法可成为一种高敏感性和特异性的方法［6］。

Northern Blot及其衍生方法对miR的定量而言，有一定的优势，并且也是国际上公认的检测miR的“金标准”［7］，现已被广泛应用于miR的表达分析。但用这类方法检测需要的RNA样本量非常大，技术复杂，费时、费力，并且对RNase污染非常敏感，任何一步操作不当都会影响其准确性。因此对检测人员专业程度要求非常高，所以就不可避免地限制了其应用，使其很难引入临床检验。

本研究在检测miR－21上应用了通用型荧光染料SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法，同时检测14对乳腺癌组织和癌旁组织。用t检验比较SYBR GreenⅠ染料法检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR－21的表达结果间有显著性差异，比较TaqMan探针法检测乳腺癌组织及癌旁组织中miR－21的表达结果间有显著性差异，比较SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR－21的表达结果间无显著性差异，并同时应用Northern Blot法进行验证，检测乳腺癌组织及癌旁组织中miR－21的表达，结果与染料法和探针法相符，证明染料法与探针法检测结果可靠。SYBR GreenⅠ染料法熔解曲线单一特异性好，无非特异性产物和引物二聚体。在优化好实验反应条件提高荧光染料检测的特异性，避免非特异性荧光检测的前提下，SYBR GreenⅠ染料法替代Taq-Man探针法进行多个基因定量表达的检测是完全可行的。SYBR GreenⅠ染料法精确度高，成本相对较低，是更加适用于临床应用的检验方法。

此研究后续还可进行血、乳腺癌组织中的miR－21与乳腺癌的分型、分期、进展和预后的相关性研究，以此为乳腺癌的诊治提供更多、更可靠的依据。

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