宫颈癌性别决定基因9基因启动子区甲基化水平检测对宫颈癌的价值研究

巫剑红，田玉翠，万治安，代荫梅

宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居女性恶性肿瘤第2位，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一［1］。人乳头瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)感染被认为是宫颈癌病因学最重要的危险因素。但HPV感染只是宫颈癌发生的必需但不充分病因，即在宫颈癌的自然形成过程中尚需要其他辅助因素的参与，但其诱导宫颈癌变发生的分子生物学机制尚不明确［2］。近年来研究发现，很多基因的甲基化与宫颈癌的发生、发展密切相关，比如 p16、MGMT、PAX1 和 RASSF1A［3－5］。性别决定基因9(sex determining region Y－box 9，SOX9)最早是从一种性别反转畸形的遗传性疾病——Campomellic dysplasia(CD)患者中克隆得到的，是软骨及其他组织包括中枢神经系统及泌尿生殖系统中的表达转录因子。SOX9可通过促进细胞凋亡而发挥肿瘤抑制作用，并可抑制癌胚抗原的表达［6］。目前研究表明，在膀胱癌［7］、滤泡性淋巴瘤［8］、套细胞淋巴瘤［9］和乳腺癌［10］等肿瘤中均可检测到 SOX9基因启动子区甲基化，本研究采用双探针定量检测宫颈脱落细胞SOX9基因启动子区的甲基化水平，探索其作为分子标记物在宫颈癌诊断、治疗和预后评估中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源 采集2010年3月—2011年1月首都医科大学附属北京妇产医院正常宫颈脱落细胞标本 (正常宫颈组)和宫颈癌脱落细胞标本 (宫颈癌组)，各48例。正常宫颈组年龄25～65岁，平均 (39.5±9.5)岁。宫颈癌组年龄21～73岁，平均 (41.0±11.2)岁。按照宫颈癌的国际妇产科联盟(FIGO)分期 (2009)宫颈癌患者中Ⅰ期20例、Ⅱ期22例、Ⅲ期6例，鳞状细胞癌43例、腺癌5例，细胞学分级G1～G235例、G313例。所有标本经病理检查确诊。均无其他肿瘤罹患证据，术前未接受放、化疗。

1.2 试剂与仪器 基因组DNA提取试剂盒 (博尔诚北京科技有限公司，Cat#K5016005);DNA甲基化检测试剂盒 (博尔诚北京科技有限公司，Cat#K5082100);引物和探针 (由博尚生物技术有限公司合成);离心机 (Eppendorf，Centrifuge 5430R);PCR 仪 (Applied Biosystems，7500 Real Time PCR System)。

1.3 样本采集 采用新柏氏液基薄层细胞学检测收集系统采集标本。采集方法:擦去宫颈上的黏液，将宫颈刷插入子宫颈内，顺时针方向旋转5圈，采集宫颈鳞柱交界处及颈管的脱落细胞，将收集的细胞洗入保存液中。宫颈刷搅拌约10次，使细胞充分进入保存液。旋紧瓶盖，做好标本标识，置于4℃冰箱保存。采用新建立的Taqman探针聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)甲基化水平检测方法，测定宫颈癌脱落细胞和正常宫颈脱落细胞中SOX9基因启动子区甲基化水平。

1.4 定量PCR检测 收集的标本置50 ml离心管，8 000 r/min离心15 min，弃去上清液，按基因组DNA提取试剂盒说明提取脱落细胞的基因组DNA。按照DNA甲基化检测试剂盒说明书步骤对DNA进行亚硫酸盐修饰，修饰后的DNA置于－20℃冰箱保存。定量PCR反应的引物及探针由博尚生物技术有限公司合成。PCR引物:上游引物5'－GTATTAATTATAGGAGYGGTTGG－3'，下游引物 5'－TCTATTCCAATTCCCCAAACC－3'，扩增片段长度为105 bp;探针:检测甲基化SOX9基因的探针序列:Methy 5'－FAM－TTCGCGATACGGGGATTTGTTT－BHQ1－3';检测非甲基化SOX9基因的探针序列:Unmethy 5'－HEX－TGGGAGTTTGTGATATGGGGATTTBHQ1－3'。PCR扩增采用罗氏PCR反应体系 (20 μl):2×LightCycler480 Probes Master(Roche Scientific，Cat#4887301001)10.0 μl，上下游混合引物 (10 μm)1.0 μl，探针 (5 μm)1.0 μl，dH2O 7.0 μl，DNA 模板 1.0 μl。反应条件:94℃ 3 min;(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s) ×45个循环。PCR扩增时以正常宫颈脱落细胞DNA样本作正常对照，以等量去离子双蒸水代替模板DNA作阴性对照。

1.5 甲基化水平的表示方法 临床宫颈癌脱落细胞样本中除了含有肿瘤细胞，还含有炎症细胞、血管内皮细胞、结缔组织等非肿瘤细胞。因此脱落细胞DNA同时存在来自肿瘤细胞甲基化的SOX9基因和来自非肿瘤组织非甲基化SOX9基因。为了定量获得组织样本SOX9基因启动子区甲基化和非甲基化的比率，采用了甲基化分值 (methylation score，MS)来表示甲基化水平:

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计包进行数据处理。计量资料以 (±s)表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MS比较 宫颈癌和正常宫颈脱落细胞样本的SOX9基因启动子区平均 MS分别为 (47.7±24.7)和 (11.4±5.0)，差异有统计学意义 (t=10.048，P=0.000)。

2.2 宫颈癌病理特征与MS的关系 宫颈癌组中鳞癌SOX9基因启动子区MS高于腺癌，G3高于G1～G2，有淋巴结转移的高于无淋巴结转移的，有脉管癌栓的高于无脉管癌栓的，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 宫颈癌病理特征与MS的关系Table 1 Relationship between pathological features and MS in cervical cancer

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容，其在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。在真核生物基因组中约80%的CpG位点被甲基化，这些甲基化主要发生在基因启动子区域的CpG岛［11］。DNA甲基化异常可通过影响染色体结构以及癌基因和抑癌基因启动子区表达而参与肿瘤的形成。抑癌基因的启动子区甲基化与某些肿瘤的临床分期和病理特征紧密相关，逐渐成为肿瘤诊断、治疗和预后评估的分子标志物［12－13］。

目前检测基因启动子区甲基化大多采用甲基化特异性PCR法［14］和荧光定量PCR［15］。本研究针对靶基因 SOX9基因启动子区甲基化状态和非甲基化状态各设计了Taqman探针，利用双探针在同一个反应管中测定SOX9基因启动子区甲基化和非甲基化状态的比例，建立了评估SOX9基因启动子区甲基化水平的一种定量检测方法。

SOX9是软骨细胞及多种组织如中枢神经系统和泌尿生殖系统组织的转录因子［16－17］。SOX9可区分间质软骨肉瘤和其他骨细胞肿瘤［18］，可调节维甲酸类介导的乳腺癌细胞的生长［19］。在前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和膀胱癌中发现SOX9的肿瘤抑制作用［6，19－21］。SOX9基因启动子区甲基化的研究有助于了解SOX9在这些肿瘤中参与肿瘤抑制和肿瘤进展的分子生物学机制。本研究也显示，宫颈癌标本的SOX9基因启动子区MS就明显高于正常宫颈标本，提示甲基化SOX9可能用于宫颈癌的分子生物学诊断。

另外本研究还显示，在宫颈癌组中SOX9基因启动子区MS宫颈鳞癌中高于腺癌，且高细胞学分级比低细胞学分级高，有淋巴结转移和有脉管癌栓的明显高于无淋巴结转移和脉管癌栓的，提示SOX9基因启动子区甲基化与宫颈癌的发病机制密切相关，且可能作为宫颈癌预后不良的分子标记物。这与国外学者在其他肿瘤中对SOX9基因启动子区甲基化的研究结果相同。Aleman等［7］对101例膀胱癌的研究中发现SOX9基因启动子区甲基化发生在56.4%的膀胱癌中，是膀胱癌的频繁事件，具有肿瘤特异性。Sun等［22］在胃癌中研究发现SOX9基因启动子区甲基化程度与胃癌分期、血管浸润、淋巴结转移和人类疱疹病毒感染呈正相关。Enjuanes等［9］研究发现在套细胞淋巴瘤中SOX9基因启动子区甲基化水平高与肿瘤细胞增殖速度快、染色体异常和患者生存时间短呈正相关，提示SOX9基因启动子区甲基化可作为胃癌预后的分子标记物。而本研究发现，SOX9基因启动子区甲基化与宫颈细胞学分级、有无淋巴结转移和脉管癌栓密切相关，而这三者对于宫颈癌的进一步治疗如再次手术、放疗和化疗等具有重要的指导意义，因此SOX9基因启动子区甲基化可用于指导宫颈癌的治疗。

SOX9基因启动子区甲基化不仅与宫颈癌的发生、发展密切相关，还可以用于指导宫颈癌的诊断、治疗和预后评估。甲基化SOX9可能为未来宫颈癌的治疗靶点之一。本研究建立的DNA甲基化双探针技术平台，只要更换引物和探针，还可以方便地应用于其他基因的甲基化检测，为临床标本的分子生物学研究提供了可靠的技术支持，是甲基化检测未来的发展方向。

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