BNIP3在细胞凋亡与自噬中的作用

徐 冉，魏珑珑，李志强，李晓锋，韩丽辉

(1 山东大学医学院，济南 250012;2 安丘市立医院)

BNIP3属于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亚家族，其结构、细胞内定位、对细胞生存的调控与BH3-only亚家族的其他蛋白不尽相同。近年来研究发现，BNIP3不仅参与细胞的凋亡，同时调控细胞自噬和坏死等过程。在不同的外界环境下，其调控方式和作用效应也不尽相同，其调控方式的复杂性预示着其生物学活性的多样性。阐明其作用机制对于理解和控制多种病理、生理过程具有重要意义。本文就BNIP3在细胞凋亡与自噬中的作用作一综述。

1 BNIP3的结构与定位

1.1 BNIP3的结构 BNIP3是一种能与腺病毒E1B19kD蛋白相互作用的蛋白质，BNIP3基因定位于10号染色体10q26.3，包含6个外显子，基因序列全长585 bp，编码194个氨基酸，分子量约21 kD［2］。Bcl-2家族蛋白是参与调节细胞凋亡的主要蛋白之一，所有成员的蛋白结构中包含至少1个Bcl-2同源结构域(BH1～BH4);而作为仅含BH3同源结构域的BNIP3，主要包含以下功能结构域［4，5］(图1):①PEST结构域:位于54～81位氨基酸，可被胞质内的蛋白酶迅速降解，是BNIP3蛋白降解的靶位点，调节细胞内BNIP3蛋白的含量。②BH3结构域:位于104～119位氨基酸，绝大多数促凋亡蛋白通过此结构域与抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL)形成异二聚体后发挥促细胞凋亡功能［1］，而BNIP3的此序列与其他Bcl-2家族也有所不同，BNIP3不通过此途径形成异源二聚体，此结构域参与BNIP3介导的Caspase依赖性线粒体凋亡途径。③氨基端结构域(NH2结构域):位于1～49位氨基酸，与BH3结构域具有相似的功能，BNIP3此结构域与TM结构域在形成二聚体促进细胞凋亡中有着重要作用［1］。④C-末端跨膜区(TM):位于164～194位氨基酸，是BNIP3行使其促凋亡功能的最重要的结构域。对促进细胞凋亡、同源二聚化、介导BNIP3定位到线粒体、活化BNIP3至关重要［1］。但也有相关研究提示，C末端TM的同源氨基酸序列可能不是凋亡所必需的，该结构介导细胞非Caspase依赖性的线粒体凋亡途径［3］。

图1 BNIP3的结构简图

1.2 BNIP3的定位 正常生理条件下，人类多种正常组织中均有BNIP3的表达，但表达量很低，仅能从人脑细胞和骨骼肌细胞中检测到BNIP3的表达［2，5～7］，但也有部分细胞不表达 BNIP3，如神经元细胞［8］;而在缺氧条件下，BNIP3的表达上调。研究证实，正常脑组织细胞中BNIP3的表达定位于细胞核;在外界压力如缺氧的诱导下，BNIP3的表达则由核转位至胞质［5］。

在多种细胞中，BNIP3核内表达之后，绝大多数存在于胞液或松散地结合在线粒体外膜上，当凋亡信号被激活时，BNIP3从胞液转移到线粒体外膜引起线粒体功能障碍，最终引起细胞死亡［1，7］。而当BNIP3与E1B19K共表达时，其表达定位于细胞核，这在多种肿瘤细胞中得到证实［5］。但当细胞核中BNIP3表达增加时，细胞死亡的数量却没有增加，这可能与BNIP3和凋亡诱导因子(AIF)的相互作用有关［10］。AIF是一种线粒体黄素蛋白，在外界刺激下，AIF从线粒体转移到细胞核，介导非Caspase途径的细胞死亡;当抑制AIF表达时，细胞凋亡的数量会有所减少;同时，在许多肿瘤细胞中也发现AIF的表达水平下降。位于核内的BNIP3能够与AIF启动子结合，招募多蛋白复合物HDAC1/PSF抑制AIF的转录和翻译，减少AIF介导的DNA裂解;这可以从一定程度上解释核内BNIP3表达增加却并未增加细胞死亡这一现象［10］。

2 BNIP3与细胞凋亡

Bcl-2家族作为细胞凋亡的中心调控环节，在整合细胞内外各种生存与死亡信号后，决定细胞是否存活，而BNIP3作为Bcl-2家族的一员，也在细胞凋亡的过程中发挥独特作用。免疫印迹研究结果显示，BNIP3蛋白存在30 kD单体和60 kD二聚体两种形式［2］;相应的研究证实，BNIP3形成同源二聚体对其发挥促凋亡功能非常重要。

2.1 BNIP3的作用方式 与其他Bcl-2家族蛋白不同，BNIP3及其同系物Nix/BNIP3L第64位氨基酸为半胱氨酸，对氧化应激压力敏感;生理条件下，因胞液处于高度还原状态，半胱氨酸始终保持着硫醇或硫醇盐的形式，因此，内源性BNIP3主要以单体分子的形式存在;而当心肌缺血—再灌注(I/R)发生时，由于产生大量活性氧，第64位半胱氨酸残基发生氧化，BNIP3蛋白之间通过二硫键形成同源二聚体;同时，BNIP3也通过COOH末端的172位丝氨酸与173位组氨酸形成氢键而形成二聚体［11］。BNIP3同源二聚体激活BNIP3，而过表达的BNIP3在线粒体外膜上形成质子通道，促进离子转导，降低线粒体膜电位和增加细胞膜通透性，引起细胞死亡。

BNIP3与其他BH3-only蛋白作用方式有很大的不同。生理情况下，BH3-only蛋白通过BH3结构域与Bcl-2家族的抗凋亡蛋白结合而促进细胞凋亡，而BNIP3则通过TM、NH2结构域与Bcl-2、Bcl-XL相互作用，通过线粒体位点和非线粒体位点发挥促凋亡功能［1］。Bcl-2、Bcl-XL竞争结合TM结构域而阻断BNIP3同源二聚体的形成，也阻断其诱导的细胞死亡的过程。Bcl-2、Bcl-XL作为抗凋亡蛋白，过表达能延缓BNIP3介导的细胞死亡［1］。

BNIP3主要分布于内质网(ER)和线粒体，其在细胞内的位置决定细胞死亡的方式［12］。位于ER的BNIP3使ER内储备的Ca2+释放，Ca2+随后在线粒体里聚集，开放MPT通道并产生大量的ROS，导致膜电位丢失，引起Caspase依赖型的细胞凋亡;而Bcl-2与三磷酸肌醇受体(IP3R)结合，阻止ER释放Ca2+及随后的细胞死亡。位于线粒体的BNIP3则引起不依赖于Ca2+的凋亡途径，BNIP3 TM结构域包含1个右手螺旋结构，并富含组氨酸—丝氨酸氢键，该结构在线粒体膜上形成一个质子通道，使胞质中的质子流入线粒体内，引起MPT开放。但Bcl-2的过表达仅能阻止定位于ER的BNIP3引起的MPT开放，而不能阻止定位于线粒体的BNIP3引起的MPT 开放［12］，具体作用机制见图2。

图2 BNIP3细胞内定位及与分子Bcl-2/Bcl-XL的作用机制图

线粒体的动态变化与凋亡需要线粒体内外膜的协调作用，而BNIP3作为定位于线粒体的蛋白质，在调控线粒体裂变这一过程中发挥重要作用。BNIP3也可以通过解离Bcl-2、Bcl-XL来间接活化Bax、Bak，调节 Ca2+浓度，促进 MPT开放，诱导细胞死亡。研究发现，当心肌细胞I/R损伤时，如果细胞缺乏Bax/Bak，即使BNIP3过表达，细胞对缺氧仍然表现为耐受，细胞死亡数量并未增加;说明BNIP3能够通过活化促凋亡蛋白Bax/Bak引起线粒体功能障碍，发挥促凋亡功能。

2.2 BNIP3的凋亡调控机制 正常组织细胞中，BNIP3的表达受到严格的控制，过表达会引起细胞死亡，细胞内存在很多机制可以调控BNIP3的作用效应，如通过抑制转录来抑制BNIP3的表达或抑制BNIP3的同源二聚化以抑制其活化等。

2.2.1 p53与BNIP3介导凋亡的关系 近期研究发现，p53能够通过抑制BNIP3的表达以抵抗缺氧引起的细胞死亡，这与以往p53促凋亡作用是不同的［14］。实验证实，在正常氧含量和缺氧情况下，p53均能抑制BNIP3的表达，这个过程是通过p53的DNA结合区直接抑制BNIP3的启动子实现的［6］。BNIP3是低氧应答基因，其表达受缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控。Hela细胞实验证实，HIF-1α过表达引起BNIP3表达升高。而在缺氧或 HIF-1α诱导BNIP3表达的过程中，p53并未参与，说明BNIP3是由缺氧或HIF-1α直接诱导表达的。BNIP3的过表达会引起不同寻常的凋亡过程，没有细胞色素C从线粒体释放，而Caspases抑制剂的使用也不能阻止细胞死亡，因此，HIF-1诱导的BNIP3的表达上调在低氧引起的细胞凋亡中起重要作用。

2.2.2 Rb与BNIP3介导凋亡的关系 研究表明，缺氧条件下在幼鼠的肝细胞、胚胎成纤维细胞、肿瘤细胞系中，视网膜母细胞瘤抑制基因(Rb)的缺失能够导致BNIP3的表达恢复，即Rb通过抑制BNIP3的表达抵抗缺氧引起的细胞死亡［13］。BNIP3启动子附近存在两个保守位点:HIF反应元件(HRE)和E2F结合位点。E2F转录因子作为细胞周期调控因子，通过结合到靶基因启动子中的特殊DNA序列来调节基因的表达，目前发现有5个不同的E2F家族成员，E2F-1到E2F-5。正常氧含量下，大量E2F-4和少量E2F-1结合在 E2F处，而 E2F-3、pRB、HIF-1α不结合BNIP3启动子序列，此时BNIP3的转录受到抑制;缺氧条件下，E2F-1取代E2F-4结合在E2F位点，HIF-1α结合在HRE，pRB/E2F-1复合物限制了 HIF-1α介导的 BNIP3的表达，HIF-1α与HRE结合也限制了E2F-1过量表达时的应答反应，但HIF-1α与pRB、E2F-1之间的作用机制尚不清楚;在缺失pRB的细胞中，缺氧时BNIP3的表达未受抑制［13］;BNIP3在常氧和乏氧条件下的表达调控见图3。

图3 BNIP3在常氧和缺氧条件下的表达调控模式图

2.2.3 其他因子与 BNIP3介导凋亡的关系 在A549肺泡上皮细胞中发现，肿瘤坏死因子(TNF)能够促进 BNIP3表达引起的细胞死亡，包括依赖Caspase-8/Bid的凋亡途径或不依赖Caspase级联反应的坏死途径［15］;当TNF与TNF受体结合后，Bid/Bax/Bik插入到线粒体外膜，信号通路活化，BNIP3转录或翻译上调，但BNIP3却不参与Caspase-8/Bid介导的细胞死亡，而主要通过产生ROS、活化溶酶体引发细胞死亡。在巨噬细胞和小肠细胞中，NO也能够通过激活RAS信号途径诱导BNIP3的表达;用三氧化二砷、氰化物等毒素处理细胞，能够通过激活HIF-1因子引起BNIP3的表达［9］。这些研究表明，很多细胞间的应激反应都会引起BNIP3表达的增加，并通过BNIP3的效应介导细胞死亡。

3 BNIP3与细胞自噬

自噬是许多细胞发生的基本现象，但当细胞间营养减少或氧气压力增加时，这种现象会增加;但自噬通过清除蛋白质和线粒体来维持细胞存活的同时，对细胞也是不利的;线粒体数量的恒定对细胞有重要作用，清除受损的线粒体对细胞的生存是必要的，抑制自噬将引起坏死样的细胞死亡［18］。

3.1 BNIP3与自噬的关系 许多研究表明，在多种不同的细胞中，BNIP3能够促进自噬［17］，具体机制尚不清楚;在缺氧等外界压力情况下，细胞通过BNIP3介导的自噬来对抗外界压力，维持生存;但部分细胞能够发生自噬性死亡。

近期研究发现，BNIP3可以激活线粒体自噬，在不改变线粒体通透性和不依赖于凋亡的前提下，BNIP3介导线粒体的氧化磷酸化而破坏线粒体，且BNIP3减少了线粒体氧化呼吸过程中必需蛋白质的含量，因而减少线粒体磷酸化和细胞ATP水平，促进线粒体翻转，可引起自噬［8～16］。

细胞质Ca2+浓度的升高、氧化压力的增加、mPTP的开放均被认为是细胞诱导自噬的原因，促凋亡蛋白Bcl-2也曾被报道通过扰乱内质网来增加细胞内Ca2+的浓度。对成人心肌细胞的研究发现，营养匮乏引起的自噬不能被透膜的Ca2+螯合剂BAPTA-AM、mPTP的抑制剂环孢霉素 A(CsA)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制，BNIP3引起的自噬并未被这些阻断剂所阻断，说明BNIP3引起的线粒体自噬和细胞死亡是不依赖于mPTP途径的。

3.2 轻链蛋白3(LC3)与BNIP3介导的自噬之间的关系 BNIP3与其他BH3-only的Bcl-2家族成员不同，尽管BNIP3介导的细胞死亡依赖于Bax/Bak途径，但BNIP3介导的自噬不依赖于Bax/Bak途径［18］;同时，免疫沉淀反应显示，BNIP3与自噬蛋白LC3蛋白相互作用。近期研究表明，BNIP3的同系物Nix(也称作 BNIP3L)直接与自噬蛋白 LC3、GABARAP相互作用，并招募GABARAP而使线粒体去极化，同时Nix结合在自噬小体上的LC3能将线粒体绑定在自噬小体上;对于BNIP3是如何将线粒体定位到自噬小体、BNIP3是否也是自噬的受体目前尚不清楚［19］。在 BNIP3过表达的细胞中，Western blot结果显示，内源性LC3-Ⅱ含量增多;同时在心肌细胞中的研究显示，BNIP3诱导的自噬呈剂量依赖性，表明BNIP3在自噬小体—溶酶体途径中是一种有效活化剂。在电镜下可观察到自噬小体、LC3的定位过程;当阻断BNIP3的表达而阻断缺氧引起的自噬和细胞死亡时，LC3在自噬小体的定位并未受影响，这表明BNIP3参与自噬小体—溶酶体的融合。相反，阻断BNIP3的表达能够阻断LC3的转化和减少自噬性的细胞死亡［21］。

3.3 mTOR通路与BNIP3介导的自噬之间的关系 研究显示，BNIP3介导的自噬能够通过mTOR通路介导。mTOR调节许多生物过程，包括蛋白质的翻译、核糖体的合成、自噬和代谢，并可协调细胞内外信号。在mTOR途径中，BNIP3直接结合Rheb，引起Rheb GTP减少，进而抑制mTORC2的功能，其中BNIP3的TM结构域与Rheb的Cys181相互作用。进一步研究发现，在缺氧微环境下，BNIP3的BH3结构域作为HIF-1的作用靶位，能与Beclin-1-Bcl-2或Beclin1-Bcl-XL复合物相互作用，通过破坏复合物释放Beclin-1引发自噬，而不引起细胞死亡，由BNIP3/BNIP3L介导的缺氧下的自噬是一种保护机制，可以促进肿瘤转移［20］。常氧状态下，BNIP3和BNIP3L的BH3结构域足以启动自噬;缺氧环境下，BNIP3和BNIP3L(作为HIF的两个作用靶位)表达同时受抑制时，缺氧引起的自噬才会受到抑制。

综上所述，BNIP3作为促凋亡蛋白，在正常生理条件下不同细胞内其表达水平有所差异，并适度调控细胞的生存与死亡;在各种外界压力下，尤其是在缺氧条件下，细胞内高表达的BNIP3通过不同的途径来调节细胞活动，不仅促进细胞凋亡，同时也可通过增加细胞自噬使细胞存活，表明BNIP3很可能在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。BNIP3在细胞内的作用效应和作用机制还需进一步探讨，相关研究的深入将为肿瘤的靶向治疗提供新途径。

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