CaMKⅡ在神经缺血性损伤中的作用

李海涛，李玉明

(首都医科大学燕京医学院，北京 101300)

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，为Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能酶成员，广泛分布于神经组织，参与调节突触传递过程，形成长时程增强(LTP)，是介导学习和记忆的关键物质。此外，CaMKⅡ还具有调节靶基因转录等多种功能。脑缺血损伤的机制复杂，涉及兴奋性氨基酸毒作用、钙离子超载及氧化应激生成自由基等因素。在脑缺血损伤的病理过程中，CaMKⅡ起着极为关键的作用。本文对CaMKⅡ在神经缺血性损伤中的作用进行综述。

1 CaMKⅡ生物特性

CaMKⅡ是一种多功能蛋白激酶，在海马和皮层中表达较高，约占海马总蛋白的2%;神经元的胞体和树突中CaMKⅡ含量最高，其次是神经末梢。电镜下发现，CaMKⅡ主要定位于浆膜、线粒体和突触后颗粒(PSD)。CaMKⅡ分子由 α、β、γ、δ 4种亚单位构成，每种亚单位均有单独的基因编码。序列分析显示，CaMKⅡ分子中包含有1个位于N末端的接触催化区、1个调节区、1个可变序列和1个位于C末端的亚基偶联区。其中调节区又由自身抑制域、钙调素结合域和自身磷酸化位点组成。当Ca2+/CaM缺乏时，CaMKⅡ调节区的自身抑制域和催化区相结合，从而阻止了底物蛋白和催化区结合，CaMKⅡ处于非激活状态;当Ca2+/CaM复合物形成时，其作用到CaMKⅡ结合区，使CaMKⅡ分子构象发生改变，使邻近亚基的结构域发生T286磷酸化，自身抑制区失活，CaMKⅡ被活化，这一过程为Ca2+依赖性磷酸化;与此同时，T286磷酸化进一步催化酶自身磷酸化位点(T305/306)磷酸化，因而当Ca2+缺乏时，催化区处于持久活化状态，催化底物磷酸化，酶的这种不依赖Ca2+的自身磷酸化激活称为自身磷酸化。具备两种激活方式是CaMKⅡ的独特特征［1］，其中自身磷酸化涉及细胞损伤机制［2］。

2 CaMKⅡ与缺血性神经损伤

2.1 神经缺血损伤过程中CaMKⅡ活性变化 在生理情况下，脑组织中CaMKⅡ水平低，但足以维持细胞内正常生化反应需要和正常的突触信息传递。短暂脑缺血激活CaMKⅡ，表现为CaMKⅡ磷酸化水平升高，急性严重脑缺血，CaMKⅡ磷酸化水平及蛋白表达均降低［3］。永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，检测出缺血2周CaMKⅡ活性呈现为先升高后降低，最后显著低于正常的变化过程［4］。

2.2 CaMKⅡ与兴奋性毒性 兴奋性毒性是神经缺血损失的原因之一，脑缺血触发神经元缺氧去极化，解除了Mg2+对N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抑制，同时，脑缺血过程中，谷氨酸的浓度升高，过度激活NMDAR受体和AMPA受体(AMPAR)诱发Ca2+超载，高浓度的Ca2+激活了细胞凋亡和坏死信号通路，而CaMKⅡ恰是兴奋性毒性-Ca2+超载—细胞损伤通路中关键性酶，因此，CaMKⅡ及其底物变化涉及缺血性神经损伤［5］。

2.3 CaMKⅡ自身磷酸化与神经缺血损伤 在大脑中动脉阻断(MCAO)模型和原代培养的小鼠大脑皮层细胞上证实，用特异性抑制CaMKⅡ活性的肽tatCN21、tatAIP抑制Ca2+依赖的磷酸化和自身磷酸化，可明显减轻谷氨酸所致的神经元损伤，这种保护效应即使在皮层细胞损伤发生2 h之后，应用tatCN21仍然出现;而传统的CaMKⅡ抑制剂KN93只在损伤刺激存在期间具有神经保护作用，随着损伤刺激结束，其保护作用消失。这是因为KN93不能抑制损伤刺激诱发的CaMKⅡ自身磷酸化，而tatCN21和tatAIP不仅可以抑制Ca2+依赖的磷酸化，还可以抑制CaMKⅡ自身磷酸化。CaMKⅡ自身磷酸化被认为是恢复血流后细胞损伤的重要机制之一，提示抑制CaMKⅡ自磷酸化可能是启动脑缺血损伤保护作用更为重要的靶点。同样，CaMKⅡ自磷酸化缺失的基因突变体T286A小鼠，较CaMKⅡ过度表达的野生型小鼠，更能耐受谷氨酸兴奋毒性［2］。然而，Waxham 等［6］发现，缺血时 CaMKⅡ基因敲除小鼠比野生型小鼠脑梗塞面积大2倍，提示，尽管抑制CaMKⅡ活性可保护细胞，但CaMKⅡ的完全消失对缺血后细胞的生存却是致命的。低水平CaMKⅡ活性对缺血后神经元功能的维持可能是至关重要的。

2.4 CaMKⅡ-PSD-95-GluR6复合体与脑缺血损伤 CaMKⅡ的活性异常是引发脑缺血再灌损伤的重要因素之一，这与兴奋性突触后密集区相关蛋白(PSDp)介导的突触后信号通路的激活有关。位于兴奋性突触后密集区(PSD)的相关蛋白主要有CaMKⅡ、PSD-95和GluR6等，是在兴奋性突触后密集区中纯化鉴定出的一种脚手架蛋白。通过其蛋白分子中的PDZ(1-3)、SH3和GK结构域，PSD-95可募集多种信号分子，在谷氨酸受体的信号整合和转导中起关键作用［7］。

脑血管结扎脑缺血再灌注时，谷氨酸释放激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ易化CaMKⅡ-PSD-95-GluR6复合体的形成，促使GluR6的丝氨酸磷酸化，进一步激活JNK信号传导通路，进而导致细胞的死亡，即谷氨酸的兴奋性毒性作用。Liu等用CaMKⅡ的反义核苷酸抑制CaMKⅡ的表达，减轻了缺血再灌注3～5 d的大鼠海马CA1区神经元的凋亡，进一步提示CaMKⅡ蛋白量的增高及与突触后密集区相关蛋白的相互作用在脑缺血再灌损害中的作用［8，9］。

2.5 CaMKⅡ激活介导缺血性神经损伤的机制 尽管通过抑制CaMKⅡ自磷酸化可以减轻缺血后细胞死亡的研究结果很多，这些研究也证实了CaMKⅡ自磷酸化引起的异常激活与缺血性神经细胞的损伤有关，但其确切机制仍不十分清楚。目前认为，可能与CaMKⅡ诱发的促细胞死亡因素的活性被削弱有关。与CaMKⅡ激活有关的促进细胞死亡的因素包括:①缺血坏死与凋亡相关的AMPA受体。AMPA受体(GluR1 S831)磷酸化后其电导增加，进而诱发致死性的Ca2+超载。与GluR1基因等效的AMPA受体，其活化后比介导Ca2+内流的GluR2受体具有更明显的致细胞死亡的效应［10］。②VDCCs通道激活。CaMKⅡ通过易化或增强VDCCs通道，进一步加重Ca2+超载［11］。③细胞间的连接蛋白稳定性降低。CaMKⅡ直接作用于细胞间的连接蛋白，破坏脑组织的内环境稳态，使神经元与胶质细胞之间信息与物质的交流减少，最终引起细胞死亡［12］。④质子敏感的离子通道被激活。通过磷酸化质子敏感的离子通道，增强缺血激活离子通道的活性，也是CaMKⅡ引起神经细胞死亡的原因之一［13］。⑤CPEB4向胞核转位。最近研究发现，CaMKⅡ激活诱发的CPEB4由胞质穿梭至胞核，启动细胞内原性损伤机制，是CaMKⅡ介导的缺血性神经细胞死亡的又一通路。CPEB4基因敲除同样导致神经元死亡;通过导入该基因使其重新表达，则可阻断或逆转细胞的死亡。CaMKⅡ异常激活所致的细胞核CPEB4积聚或向核内转位可能是CaMKⅡ介导的缺血性神经元死亡的机制之一［14］。

3 CaMKⅡ膜转位在脑缺血性损伤保护中的作用

生理情况下，绝大部分CaMKⅡ作为可溶性成分存在于胞质中，其余小部分存在于膜相结构中。脑缺血15 min后，大鼠皮层和海马的膜相成分中CaMKⅡ增加50%，提示缺血促进了CaMKⅡ由胞质向胞膜转位，这种转位与PKC的不可逆膜转位不同，短暂缺血所致的CaMKⅡ在胞质和胞膜之间的转位是可逆的。短暂缺血后，胞质CaMKⅡ活性仍然可以被检测，但CaMKⅡ mRNA明显降低，表达的下降，及膜转位引起的胞质CaMKⅡ活性进一步下调［15］。

脑缺血后谷氨酸的释放，作用到NMDA受体，引起Ca2+内流，最终导致CaMKⅡ两个方向的转位。首先是向突触后膜和突触外簇的转位。生理情况下，谷氨酸刺激诱发CaMKⅡ向突触后膜转位，并与几种突触蛋白结合，维持突触正常形态及可塑性，参与学习与记忆过程;病理情况下，谷氨酸刺激和缺血状态，使CaMKⅡ转移到突触膜，与几种突触蛋白特别是GluN2B(NR2B)结合，形成一种非溶解状态的复合物介导突触蛋白的凝聚［16，17］。上述两种类型的转位皆需经由CaMKⅡ T位点的蛋白相互作用。CaMKⅡ与突触蛋白的聚集需pH低于6.8的环境条件，脑缺血时局部酸中毒可能有利于这种聚集，其详细分子机制尚不十分清楚，目前认为可能与自磷酸化时α螺旋铰链的282位组氨酸质子化有关［18］。

脑缺血过程中，Ca2+/CaM诱发的CaMKⅡ转位或聚集使其在胞质中的活性降低，进而减轻胞质CaMKⅡ异常激活引起的细胞损伤。推测CaMKⅡ的移位和聚集可能是缺血时细胞启动内源性保护性机制的方式之一。

4 适当浓度的CaMKⅡ对缺血性脑损伤具有保护作用

Ashpole等［5］将海马神经元暴露于谷氨酸的兴奋毒性作用，并在暴露前、后短时间应用KN-93、tat-AIP及tat-CN21等CaMKⅡ抑制剂，发现抑制CaMKⅡ异常激活可降低海马神经元的死亡率。虽然抑制CaMKⅡ过度激活可产生保护作用，但持续抑制CaMKⅡ活性超过8 h后，保护作用丢失，细胞死亡率反而升高。过度抑制CaMKⅡ的活性得到相反的结果，这些研究提示，维持胞质中CaMKⅡ一定程度活性对细胞生存至关重要。

适量活化的CaMKⅡ通过以下4个方面的机制减轻细胞的损伤:①CaMKⅡ通过磷酸化nNOS，抑制其活性，降低一氧化氮合成酶(nNOS)诱发的神经元损害。尽管谷氨酸的释放会产生一定程度的兴奋性毒性，但恰当浓度的CaMKⅡ通过谷氨酸激活NMDA受体，可分解nNOS，减少NO的产生，减轻自由基对神经细胞的损伤［19，20］;②CaMKⅡ可通过调节某些离子通道减轻兴奋性毒性作用对神经元的损伤。如:磷酸化GluN2B受体(ser1303)，促进兴奋性效应的 NMDA受体脱敏，增强抑制性效应的GABAα受体表达，从而减轻神经元的兴奋性毒性作用;③恰当浓度的CaMKⅡ和CaMKIV可以激活具有细胞保护作用的蛋白如ErK和ScrB，同时又可抑制对细胞具有损害作用的蛋白如GSK-3和Bad，起到减轻细胞损伤的保护性作用;④组蛋白脱乙酰基酶5(HDAC5)为CaMKⅡ的底物，HDAC5抑制保护性转录因子 MEF的产生，CaMKⅡ通过抑制HDAC5，从而增强MEF表达，从而间接发挥对神经元的保护性作用。

5 结语

神经缺血损伤过程中，CaMKⅡ的作用较为复杂，一方面胞质中一定水平的CaMKⅡ活性是维持细胞生存的必要条件之一;另一方面，胞质CaMKⅡ异常激活又可触发细胞死亡信号通路而加重细胞损伤，如何恰当调控细胞质CaMKⅡ的浓度及活性，既保持细胞生存所必需又不致引起异常激活的细胞损伤是未来该领域研究的重点。

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