响应面法优化超声波辅助提取苦杏仁渣中杏仁蛋白工艺

殷振雄，张 继，*，赵保堂，宋 珅，蔺彦斌，张 继

(1.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070;2.西北师范大学化学化工学院，甘肃兰州730070)

杏仁，蔷薇科植物山杏(Prunus armeniaca L var ansu Maxim)、西伯利亚杏(Prunussibirica L)、东北杏(Prunus mandshurica Maxim)或杏(Prunus armeniaca L)的干燥成熟种子［1］。《本草纲目》记载，杏仁有“润肺脾、消食积、散滞气”三大好处，其本身含有丰富的蛋白质，既是高级营养品，又可供药用［2］。杏仁含蛋白质22.5%、脂肪44.8%、糖23.9%、膳食纤维8.0%。杏仁含有丰富矿物质，每100g杏仁中含钙234mg、磷504mg、镁 260mg、钾 773mg、铁 4.7mg、锌 3.11mg，维生素B1、维生素B2、维生素E和胡萝卜素，杏仁中特有的苦杏仁苷达3%［3］。杏仁蛋白的氨基酸比例平衡，最优氨基酸组合和其他植物蛋白的质量相当，是一种良好的植物蛋白资源［4］。目前蛋白质提取大多利用稀盐和缓冲系统的水溶液提取法，对于不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等的有机溶剂提取法等。甘肃省平凉、庆阳地处陇东黄土高原沟壑区，自然条件非常适合杏树生长，杏产量占全省70%左右［4］。本研究利用超声波辅助提取法［5－7］，以甘肃产苦杏仁渣为原料，以杏仁蛋白提取率为指标，通过单因素和响应面实验［8－12］，研究超声波辅助条件下碱提酸沉法的不同因素变化对杏仁蛋白提取率的影响，优化了杏仁蛋白的提取工艺，并与大豆蛋白、小麦蛋白进行了性能比较，以期为进一步研究其理化功能等奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦杏仁 产于甘肃省平凉市，提取杏仁油后的苦杏仁渣粉碎后过40目筛;考马斯亮蓝G250 北京西美杰科技有限公司，分析纯;柠檬酸、NaOH、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿 天津市福晨化学试剂厂，分析纯;牛血清白蛋白 纯度98%，分析纯，Bio Basic公司。

JJ－1精密定时电动搅拌器 金坛市荣华仪器制造有限公司;KQ－250B型超声波发生器 昆山市超声仪器有限公司;pHS－25数显pH计 上海精密科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;LJG－18S冷冻干燥机 北京泰华仪器有限责任公司;TBL5M台式超大容量冷冻离心机 湘仪离心机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 杏仁蛋白的提取流程 见图1。

图1 杏仁蛋白的提取流程Fig.1 The flow diagram of extraction

1.2.2 超声辅助提取杏仁蛋白的单因素实验

1.2.2.1 超声时间对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量2.0g样品，在料液比 1∶20，pH 9.5，温度 45℃下用超声波并搅拌浸提 0.5、1、1.5、2、2.5h，然后以4000r/min离心20min。去掉油层和沉淀，取清液2.5mL稀释20倍，利用考马斯亮蓝G－250染色法在595nm波长下比色。以蛋白质的提取率为指标，绘制时间与提取率的关系曲线。

1.2.2.2 pH对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量2.0g已粉碎样品，在温度45℃，料液比1∶20，pH 为8、9、10、11、12 的条件下超声波并搅拌提取 1.5h，其余同1.2.2.1。

1.2.2.3 料液比对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量2.0g已粉碎样品，在温度45℃，pH9.5，料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 的条件下超声波并搅拌下浸提1.5h，其余同1.2.2.1。

1.2.2.4 温度对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量2.0g已粉碎样品，在pH9.5，料液比为1∶20，温度分别为 35、40、45、50、55℃ 的条件下超声波并搅拌提取1.5h，其余同 1.2.2.1。

1.2.3 Box－Behnken实验设计 采用Design－Expert 7.0软件，应用Box－Behnken设计杏仁蛋白提取率为响应值对主要影响因素进行优化，从中筛选提取杏仁蛋白提取率的最优提取条件。根据Box－Benhnken的中心组合实验设计原理，选定提取时间、pH、提取温度3个对超声提取影响的因素进行单因素实验。在单因素的基础上，确定响应面实验的因素和水平(见表1)。

表1 Box－Behnken实验设计因素水平Table 1 Levels of factors of Box－Behnken design

1.2.4 杏仁渣中蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法测定并计算杏仁渣中总蛋白的含量(ω)。通过考马斯亮蓝G250染色法测定提取液中蛋白质含量(ρ)，并按下列公式计算蛋白提取率(Y)。

式中，Y－蛋白提取率(%);ρ－提取液蛋白质量浓度(g/mL);V－提取液体积(mL);ω－杏仁渣中总蛋白含量(%);m－杏仁渣质量(g)。

1.2.5 数据处理方法 运用Design－Excerpt软件对响应值进行回归分析、方差分析，用F检验判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性。

2 结果与讨论

2.1 粗蛋白的测定

经凯氏定氮法测定，杏仁渣中粗蛋白的含量为45.5%。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取时间对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在料液比1∶20，pH 9.5，温度45℃下，不同提取时间对杏仁渣中蛋白提取率的影响如图2所示。

图2 提取时间对蛋白提取率的影响Fig.2 The influence of time to the extraction yield

由图2可知，杏仁蛋白提取率随时间的增加而增加，当处理时间大于1.5h时，杏仁蛋白的提取率开始下降，所以初步确定杏仁渣超声波提取1.5h。

2.2.2 pH对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在料液比1∶20，提取时间1.5h，温度45℃下，不同pH对杏仁渣中蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 提取pH对蛋白提取率的影响Fig.3 The influence of pH to the extraction yield

由图3可知，pH对蛋白质的提取率有明显的影响，当提取液pH8～10时，杏仁蛋白质提取率逐渐增加;当pH超过10以后，杏仁蛋白的提取率随pH的增大而减小，因此确定提取液的pH为10。

2.2.3 料液比对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在提取时间1.5h，pH 9.5，温度45℃下，不同料液比对杏仁渣中蛋白提取率的影响如图4所示。

由图4可知，随料液比的增大，蛋白质的提取率也在增大，在料液比大于1∶30后，蛋白质提取率提高变得缓慢。在实验范围内虽然料液比为1∶35时的蛋白质提取率最大为76.8%，而料液比为1∶30时，蛋白质的提取率也达到了75.6%，但是太高的料液比不利于后续处理，故选取料液比为1∶30。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

图4 料液比对蛋白提取率的影响Fig.4 The influence of material to water ratio to the extraction yield

2.2.4 提取温度对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在提取时间1.5h，pH 9.5，料液比1∶30下，不同提取温度对杏仁渣中蛋白提取率的影响如图5所示。

图5 提取温度对蛋白提取率的影响Fig.5 The influence of temperature to the extraction yield

由图5可知，随着温度的增大，杏仁蛋白的提取率呈现先增大后减小的趋势，这是由于在温度过低时，蛋白质在水中的溶解性不高，但是温度过高时，极易造成蛋白质变性，变性后的蛋白质易沉淀，经过离心，作为沉淀弃除，因此，当杏仁蛋白的提取温度高于45℃时，杏仁蛋白极易变性，导致提取率变低，故确定杏仁蛋白的提取温度为45℃。

2.3 提取条件优化

通过单因素实验，选择合理的因素水平进行响应面实验，以确定最佳的提取条件。杏仁蛋白提取的Box－Benhnken实验结果见表2。

表2 Box－Behnken实验设计结果Table 2 Results of data analysis by Box－Behnken design

2.4 响应面分析

以X1(时间)、X2(pH)、X3(温度)为自变量，杏仁蛋白的提取率Y为响应值，所得二次回归方程为:

运用Design－Excerpt软件对17个实验点的响应值进行回归分析，方差分析结果如表3所示，用F检验判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，概率越小，则相应变量的显著程度越高。

由表4可以看出，模型的决定系数(R2=0.9047)，变异系数C.V=4.34%，表明多项式模型的精确性、有效性是合理的。

表4 杏仁蛋白提取率二次项模型的适合度分析Table 4 Analysis the fitness of quadratic polynomial model for extraction yield

2.5 各因素交互作用分析

为了进一步考察3个实验因子:超声提取时间(X1)、pH(X2)及提取温度(X3)的交互作用以及确定最优点，对回归模型采用降维法分析，即可得到两因子的回归模型，并通过Design－Expert 7.0软件绘制出响应面曲线图来进行直观的分析。图6～图8分别显示了3组以提取率为响应值的趋势图，从响应面图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度。极值条件出现在等高线的圆心处，等高线图最圆，说明它们之间相互作用对杏仁蛋白的提取率的影响最大;而等高线图越扁平，表示因素之间的相互影响越小。

从图6可以看出，随着pH的增大，杏仁蛋白的提取率逐渐增大;而随着温度的升高，杏仁蛋白的提取率呈先增后平的趋势。

图6 温度和pH的交互作用对蛋白提取率的响应曲面Fig.6 Response surface showing the effects of temperature and pH on extraction yield

从图7可以看出，随着温度的升高，超声时间的延长，杏仁蛋白的提取率呈先增后减的趋势。

从图8可以看出，随着pH增大，杏仁蛋白的提取率逐渐增大;而随着时间的延长，杏仁蛋白的提取率的变化不明显。

2.6 最佳条件的确定及验证实验

从图3及Design－Expert 7.0软件分析可得，建立了一个以苦杏仁蛋白质提取率为目标值，以超声温度、pH和时间为因子的数学模型。方差分析表明其拟合较好。通过对回归方程的优化计算，得到最佳提取工艺条件:在温度47.76℃、提取时间1.18h，pH

图7 温度和时间的交互作用对蛋白提取率的响应曲面Fig.7 Response surface showing the effects of temperature and time on extraction yield

图8 pH和时间的交互作用对蛋白提取率的响应曲面Fig.8 Response surface showing the effects of pH and time on extraction yield

3 结论

在单因素实验基础上，运用响应面分析法对提取杏仁油后杏仁渣中的蛋白的提取条件进行优化。在超声功率恒定，料液比为1∶30g/mL，得出对蛋白提取率影响大小的因素依次为提取时间、提取温度、pH，验证实验进一步证明在温度48℃、提取时间1.2h、pH 11时，蛋白质提取率高达79.74% ±0.60%，且外观满足食品加工要求，功能特性优良。本研究为提取杏仁油后的工业废弃物杏仁渣的有效利用提供了理论依据。为当地杏仁蛋白的进一步深加工提供了原料来源。

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