应用SRAP标记对六个灰树花的多态性分析

尹永刚，胡汝晓，李新菊，王春晖，彭运祥

(湖南省食用菌研究所，湖南长沙410013)

灰树花(Grifola frondosa(Fr.)Gray)又称栗蘑、千佛菌、贝叶多孔菌、舞茸，是一种珍贵的大型食药用真菌。野生灰树花大多发生在板栗、栎树、栲树等壳斗科树种及阔叶树树桩基部或倒腐的近地树干上，是一种典型的白腐菌，以分解树木的心材为营养，造成树木心材腐朽［1］，其姿态优美，香气浓郁，味道鲜美，柔软脆嫩，子实体富含蛋白质、纤维、维生素，是一种深受人民喜爱的营养保健食品［2］，在药用价值上具有抗肿瘤、免疫刺激、抗血栓、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗氧化及增强生命力等多重功效［3］。目前国内外关于灰树花的研究报道主要集中在栽培技术和生物活性物质成分与功能研究［3－4］等方面，而关于该菌种的分子生物学研究报道较少。由于目前国内生产上菌种管理混乱，以及认识上的混乱致使“同名异物、同物异名”的现象普遍存在，给科研带来许多不必要的重复，也阻碍了菌种的调剂供给。由于技术上的复杂性，传统的鉴定方法如拮抗、同工酶分子等技术已经跟不上科技的发展，而标记技术的出现大大的降低了解决这一问题的困难。序列相关扩增多态性(Sequence－related amplified polymorphic，SRAP)标记技术是2001年由Li和Quiros开发出的一种新型的基于PCR的标记系统［5］。该标记是通过独特的引物设计对ORFs(Open Reading Frames)进行扩增。上游引物长17bp，下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增［6］。因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有检测简单，重复性好，每对引物都能够产生适度的多态性标记，而且其中一部分是共显性标记，能够比较容易地分离目的标记并测序等［7］。目前SRAP标记已经在香菇 (Lentinula edodes)［8］、黑 木 耳 (Auricularia auricula)［9］、毛木耳(Auricularia polytricha)［10］、榆黄蘑(Pleurotus citrinopileatus)［11］、 平 菇 (Pleurotus ostreatus)［12］等食用菌上有研究报道。本研究将采用SRAP方法对6个灰树花栽培品种进行遗传关系分析，探讨不同灰树花的亲缘关系及该分子标记的多态性分析等问题，并准确地对灰树花菌种进行遗传分类，为灰树花种植资源的遗传多样性和灰树花育种亲本选配研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰树花(Gf1) 湖南省食用菌研究所;灰树花－1(Gf2)北京市农林科学院;灰树花3号(Gf3)、灰树花5号(Gf4)、灰树花53号(Gf5)三明真菌研究所;灰树花15(Gf6)浙江庆元;植物基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化公司;琼脂糖 西班牙Biowest公司;Taq buffer(Mg2+)、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 大连宝生物工程有限公司;葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;引物 上海生工生物工程有限公司;溴化乙腚美国Sigma公司;1Kb Plus DNA Ladder 北京中科瑞泰生物公司。

电泳仪JY600C 北京君意东方电泳设备有限公司;HYG－A型恒温振荡摇瓶柜 太仓市实验设备厂;Eppendorf 5415R台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司;Eppendorf Mastercycler gradient PCR仪 德国Eppendorf公司;Bio－Rad凝胶成像系统美国Bio－Rad公司;Thermo精密综合培养箱、Thermo生物安全柜 美国Thermo公司;Bullet Blender高通量组织研磨仪 美国Next Advance公司。

1.2 菌丝体培养和基因组DNA提取

将供试菌株分别接种于PDA液体综合培养基(马铃薯 200g，葡萄糖 20g，MgSO41.5g，KH2PO43g，VB10.01g，蛋白胨5g，加水定容至1L)中，置于25℃振荡培养箱中，130r/min条件下恒温培养10d。菌丝体基因组DNA采用植物基因组DNA提取试剂盒提取。

1.3 引物与PCR扩增

SRAP－PCR扩增体系:10×Taq buffer(含Mg2+)5μL，2.5mmol/LdNTPs 1μL，20μmol 引 物 2μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5μL，基因组 DNA 模板1μL(约50ng)，ddH2O 补足50μL。反应程序为:94℃5min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 个循环;94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35 个循环;72℃10min，4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后拍照记录。

1.4 数据分析

对获得的电泳图谱进行条带统计，有带的地方记为1，无带的地方记为0，用Excel软件将原始数据转换成0/1矩阵;用NTSYS pc2.10软件进行数据分析，对原始矩阵用SIMQUAL程序求Jaccard相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵，用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree Plot模块生成亲缘关系聚类图。

2 结果与讨论

2.1 SRAP分析

对6株灰树花的基因组DNA进行SRAP－PCR的统计分析(表1)，14对引物组合共扩增出151条位点片段，其中多态性片段132条，占总片段条数的87.4%，多态性整体较高。每对引物组合扩增条带数在7～16条之间，其中引物组合me3/em13(图1－A)扩增带数最少，为7条，引物组合me5/em6(图1－B)扩增带数最多，为16条。获得多态性百分比最高的引物组合为 me1/em15(图1－D)和 me3/em13，均获得100%的多态性片段，而引物组合me2/em3(图1－C)扩增得到的多态性片段比例最低，为62.5%。

本研究所得的扩增带谱读取结果计算6株灰树花菌株之间的Jaccard相似系数，变化范围为0.3019～0.7662，其中Gf5和Gf6相似系数最高，亲缘关系最近，Gf2和Gf4遗传关系最远。应用UPGMA法聚类，构建了6株灰树花菌株的SRAP聚类图(图2)。对供试菌株在相似系数跃变处进行分类。在相似系数为0.45处取一结合线，供试6个菌株被分为3个小组，第一小组为Gf1;第二小组:Gf2和Gf3;第三小组为Gf4、Gf5和Gf6。由此可知，来自不同地区的灰树花栽培品种可能在引种来源上有交叉，其中Gf1来自湖南，被聚为一类。而另一株来自北京的Gf2同来福建的Gf3聚为一类，但亲缘关系较远;另外两株来自福建三明真菌研究所的Gf4和Gf5与浙江的Gf6聚为一类，其中Gf5和Gf6最初可能源于同一地区。

表1 SRAP引物对灰树花DNA扩增条带的多态性分析Table 1 Polymorphism analysis of the amplified bands of Grifola frondosa genomic DNA generated by SRAP primers

图1 引物组合 me3/em13、me5/em6、me2/em3、me1/em15分别对6株灰树花的扩增图谱Fig.1 Fingerprints of 6 Grifola frondosa strains generated by the primer combinations of me3/em13，me5/em6，me2/em3 and me1/em15，respectively

图2 灰树花菌株的SRAP聚类图Fig.2 The dendrogram of Grifola frondosa strains with SRAP method

王守现等［13］采用酯酶同工酶、RAPD和ISSR方法对北京地区的6个灰树花菌株进行综合分析，证明可以将6个菌株进行分类，但在该研究报道的不足之处在于，在RAPD和ISSR方法上，分别仅使用了2个RAPD引物和1个ISSR引物，因此对于菌株间的多样性分析会因为产生误差较大而导致结果不够准确。近年来，研究学者们利用SRAP技术对香菇、木耳、平菇［8－9，12］多样性评价时，都可以将种内的多个品种明显地区分开来，并达到分类的效果。Du等［10］应用SRAP技术对云南地区的毛木耳野生品种同四川与河南地区的栽培品种进行遗传多样性分析，在不同野生品种存在多样性的同时，可将野生品种与栽培品种进行区分，这与地理上位置的差异是一致的，同时也表明河南与四川地区的栽培菌可能引源于同一地区。越来越多的研究者将分子标记技术应用于食用真菌，如杏鲍菇、双孢蘑菇和香菇等［14－16］的种间和种内不同菌株的鉴定研究。分子标记手段较多，因此研究中同时采取多种分子标记比较分析的方法，比如 ISSR［17］、AFLP［18－19］、SSR［20－21］等分子技术手段，对物种进行亲缘关系和多样性研究，是今后工作研究的重点。

3 结论

灰树花具有独特的食用价值与药用价值，是近年来被越来越多的消费者喜爱的珍稀食用菌品种，因此，对于该品种遗传学及育种方面的研究，是今后工作的重点。分子标记通常以个体间遗传物质内核酸序列的变异为基础，在DNA水平上直接的反映出个体间的遗传多态性，因此，在遗传育种、基因组作图、物种亲缘关系鉴定、基因克隆等方面有广泛应用。SRAP是分子标记的手段之一，本研究采用该技术对湖南、北京、浙江和福建地区的6个灰树花栽培品种进行了亲缘关系与多态性分析，14对SRAP引物组合共扩增出151条位点片段，其中多态性片段132条，占总片段条数的87.4%，菌株间相似系数变化范围为0.3019～0.7662，同时将6个菌株分为3大类，结果表明SRAP技术能够在分子水平上分析供试菌株之间的亲缘关系，并且能有效的把不同的菌株区分开来，这也为今后优良灰树花品种的选育工作提供了有效的参考。

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