樟树叶多酚提取物体外清除自由基及抗油脂氧化活性研究

付湘晋，王 挥，冉晓敏，陈 浪，李忠海，黎继烈

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004)

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)系樟树属的常绿乔木植物，是中国亚热带绿阔叶林的主要树种之一，在中国资源非常丰富［1］。从古至今，中国就有利用樟树的木、叶、根等治病的历史，中医认为樟树有祛风除湿、行气止痛、活血化瘀、通利关节之功效［2］。中国是世界上生产芳樟油最多的国家，其产量占世界的80%。芳樟油主要以樟树枝叶为原料，采用蒸馏法生产，由于樟树枝叶中芳樟油含量只有3%左右［3］，所以有大量加工下脚料未被利用。樟树叶除含有芳樟油以外，还含多酚、类胡萝卜素、多糖、生物碱等多种生物活性物质［4］。所以，提取芳樟油后的下脚料是提取这些活性物质易得的低成本原料。酚类化合物作为一种天然的抗氧化剂，具有很强的抗氧化作用，其健康功效包括抗衰老、强化血管壁、促进消化、降低血脂肪、增加身体抵抗力、防止动脉硬化、血栓形成、利尿、降血压、抑制细菌与癌细胞生长等等，近年来，颇受研究者重视，被称为“第七类营养素”。以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品行业的发展趋势，从天然植物中寻找新的清除体内自由基的抗氧化剂也将是现代医药、保健行业的发展方向。现已有较多的植物源天然抗氧化剂被作为添加剂应用于食品工业中，如茶多酚显著抑制鱼肉的脂肪氧化［5］。本实验室前期研究发现樟树叶含有大量酚类物质，是新的多酚资源［6］。本文进一步研究了樟树叶多酚体外清除自由基及抗油脂氧化活性，为樟树叶多酚资源的利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟树叶 2010年9月于中南林业科技大学校园内采集樟属香樟树种的樟树老叶(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)，风干(测得干物质含量为47%，w/w)后粉碎，过 32目筛;邻二氮菲、过氧化氢(30%)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、盐酸、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、BHT、维生素C、硫代硫酸钠 试剂均为分析纯，购自国药集团(上海)。

722型可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;VCX500超声波细胞粉碎仪 SONICE＆MATERIALS，INC.USA。

1.2 实验方法

1.2.1 樟树叶多酚试样的制备 试样a，樟树叶经过超声波耦合双水相法提取得到的样品。提取方法:樟树叶→双水相耦合超声波萃取→樟树叶多酚提取物→减压浓缩→浓缩物→石油醚脱脂→水溶液即为游离多酚粗提取液。其中双水相体系是40%的乙醇－硫酸铵2g/10mL，超声波功率是255W，料液比是 1∶38，浸提时间是95min，浸提温度是 21℃［6］。

试样b，上述试样a提取后，所得滤渣加入5倍(v/w)4mol/L NaOH溶液，于室温下避光水解4h，冰浴中用6mol/L HCl调整溶液的pH至2，用滤渣5倍(v/w)的乙酸乙酯－无水乙醚混合液(1∶1)萃取3次，合并萃取液，于30℃下真空浓缩至干，用去离子水定容得结合多酚粗提取液［7］。

试样c，试样a、b合并后，用 AB－8大孔树脂纯化样品:准确称取经过预处理的 AB－8大孔树脂1.00g，置于150mL锥形瓶中，加入樟树叶多酚提取液50mL(多酚含量1.00g·L－1)，吸附温度 25℃，多酚溶液 pH5.68，振荡吸附 4h(100r·min－1)达到平衡后，过滤后，树脂中加入100mL洗脱溶剂60%的乙醇溶液(v/v)，震荡解析 2h(100r·min－1)，过滤后滤液于30℃下真空浓缩至干，用去离子水定容，多酚纯度为63.56%［8］。

1.2.2 多酚含量测定 以没食子酸为标准品，采用福林比色法测定樟树叶多酚含量［9］，标准曲线的回归方程是 y=0.0931x－0.0054，R2=0.9984。

1.2.3 樟树叶多酚还原力及清除自由基活性 还原力:还原 Fe3+法［10］。清除羟自由基活性:测定对Fenton反应(邻二氮菲－FeSO4－H2O2反应体系)产生的羟自由基的清除率［11］。清除 DPPH自由基活性［12］:517nm。清除超氧阴离子自由基活性［13］:邻苯三酚自氧化法。

1.2.4 樟树多酚抗油脂氧化 用电子天平准确称取50g油脂，加入试样，加热搅拌到油样为均匀透明油状物;不添加任何试剂的油样置于室温下，为空白组;不添加任何试剂的油样置于(65±1)℃烘箱中，为模型组;添加樟树多酚(多酚添加量0.04%，w/w)的油样置于(65±1)℃烘箱中，为试样组;所有样品每12h测一次POV。

过氧化值 POV(mmol/kg)的测定［14］:硫代硫酸钠滴定法。

2 结果与分析

2.1 樟树多酚抗氧化能力

2.1.1 樟多酚还原力 检测不同浓度的各类物质还原能力结果如图1所示。一般来说，物质的还原能力与其抗氧化活性成正比。因此，各类物质反应后的生成物在716nm处的吸光度的大小，可以表现出其抗氧化活性的大小，吸光度越大，就表明物质的还原能力越大。

由图1可知，试样c的还原能力随着浓度的增加而增大。而试样a和b随着浓度的增加，还原能力的增大表现不明显。还原能力顺序为VC＞试样c＞试样b＞试样a。

图1 樟树叶多酚还原能力Fig.1 Antioxidative ability of camphotree leaves polyphenol

2.1.2 樟多酚清除羟自由基活性 不同浓度的各类物质清除羟自由基的能力，如图2所示。由图2可以看出:VC的清除率最高，在4mg/mL以前VE清除羟自由基的能力要大于试样a、b、c，在4mg/mL以后试样b和试样c以及VE的清除能力相当于试样a、b、c，在4mg/mL以后试样b和试样c以及VE的清除能力相当，而试样a清除羟自由基的能力最弱。

图2 樟树叶多酚清除羟自由基的能力Fig.2 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on·OH

2.1.3 樟多酚清除DPPH自由基活性 不同浓度的各类物质清除DPPH自由基的能力实验如图3所示。

图3 樟树叶多酚清除DPPH自由基Fig.3 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on DPPH

VC在0.2mg/mL低浓度的时候清除率就达85%以上，试样b和c清除DPPH自由基的能力相当，且清除率高于同浓度的VE。叶辉等［15］报道樟科木姜子属毛豹皮樟(老鹰茶)提取物的抗氧化活性强度为:其DPPH自由基清除率在80.56%～88.19%(1mg/mL酚)，本文结果与这一报道基本一致。

2.1.4 樟多酚清除超氧阴离子自由基活性 不同浓度的各类物质清除超氧阴离子自由基活性实验如图4所示。

图4 樟树叶多酚清除超氧阴离子活性Fig.4 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on ·

由图4可以看出，VC的清除效果最好，试样a的清除效果最差。但试样b、c的清除效果与VE相当。

2.2 樟树多酚抗油脂氧化活性

油脂被氧化的程度可以用它的过氧化值(POV)表示，所以POV也是评价物质抗氧化性能的重要指标。测得油脂的POV越大，说明所含有的过氧化物越多。如果在油脂中添加了抗氧化剂，其POV应比未添加的空白样品有所下降，POV越小，表明物质的抗氧化性能越强不同浓度的试样抗油脂氧化能力的实验如图5所示。由图5可以看出，随着时间的增加，油脂的POV一直增加，空白组与模型组POV变化相似，但是樟树多酚试样组的POV增长速度比较慢。

图5 樟树叶多酚抗油脂氧化能力Fig.5 Effect of camphotree leaves polyphenol on lipid oxidation

当实验时间达到48h的时候，空白组和模型组的POV分别是15.91、16.17mmol/kg，而樟树多酚试样c组在实验时间72h时，POV为14.94mmol/kg，说明添加了樟树多酚的油脂被氧化的速度比未添加的慢。试样c把脂肪氧化的诱导期从48h推迟到84h左右。

3 讨论

樟树多酚的抗氧化特性因为樟树多酚的分子中含酚羟基，可以提供活泼的氢质子，能够有效地清除氧自由基，可以预防脂质过氧化的启动，其次，和过氧化自由基结合生成稳定的化合物，进一步阻止了氧化过程中链锁反应的传播。除此之外，樟树多酚和金属离子生成的络合物，清除羟基自由基和脂质自由基的能力，以及与自由基形成的半醌自由基的稳定性对樟树多酚的抗氧化活性的影响也很大。

试样a、b分别是游离态粗多酚、结合态粗多酚，试样c为大孔树脂纯化多酚，纯度高，它们抗氧化及清除自由基活性的差异可能是因为它们的酚类物质组成不同。酚类是一大类物质。有研究鉴定了樟科木姜子属毛豹皮樟的抗氧化成分，包括香豆酚、山奈酚、槲皮素等，但从其提取方法看，鉴定的主要是游离态酚［16］。同一材料中，结合态和游离态的酚种类往往有很大差异，如稻壳中游离态酚类物质以丁香酸和香豆酸为主，结合态酚类物质以香豆酸为主［17］。但樟树叶中两种酚的组成尚需进一步研究。

此外，还应该考虑到多酚单体物质之间的相互作用。Kanner等［18］对葡萄酒中的酚进行研究的时候发现酚类在作为抗氧化剂时，相互协同的机制起了很大的作用，活性较低的酚能够使易于被氧化的酚再生。樟树多酚提取物也有可能存在类似的作用机制。但对樟树多酚中不同的酚类物质之间协同作用或拮抗作用的机理还需要进一步研究。

4 结论

4.1 三种不同提取纯化的樟树多酚试样均有一定的抗氧化能力，其对羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基等都有一定的清除作用，特别是对DPPH自由基清除活性最强。多酚的纯度对其抗氧化活性有一定影响，经过大孔树脂纯化的试样c的清除效果最好。

4.2 在实验浓度范围内，各试样的抗氧化活性及清除自由基活性随着浓度的增加而增大，即存在量效关系。

4.3 抗油脂氧化能力的实验表明，樟树多酚可有效延长油脂氧化诱导期，从而阻止油脂氧化。开发樟多酚食品抗氧化剂具有进一步研究价值。

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