37种脂肪酸甲酯的色谱分离及QSRR研究

李 焕，李美萍，张生万

(山西大学生命科学学院，山西太原030006)

脂肪酸作为人体的必需营养素之一，在整个生命过程中起着至关重要的作用。随着生活水平的提高，人们对健康越来越重视，因此，业内专家和科研人员对膳食脂肪酸的研究也越来越多。目前，脂肪酸的检测方法最常用的是气相色谱［1－3］和气相色谱－质谱联用［4－5］。采用气相色谱检测，需要标准品对样品进行定性;采用气质联用分析时，需要人工检索解析，操作麻烦耗时，且费用较高。而定量结构－色谱保留相关 (QuantitativeStructure－Retention Relationships，QSRR)的研究主要是建立化合物分子结构参数和色谱保留值之间的定量关系，对选择分离条件、预测保留时间和探索色谱保留机理有着重要的意义。建立有效的脂肪酸甲酯化合物QSRR模型可以节省大量的人力财力，同时对脂肪酸的分析工作具有一定的指导意义。由于油脂中脂肪酸组成复杂，且结构相似，对分离柱的要求就相对较高。目前，应用较为广泛的是涂渍极性固定相的色谱柱，如聚乙二醇或氰丙基聚硅氧烷固定相。尤其是对组分较多的脂肪酸甲酯混合样品的分离，一般选用柱长较长的脂肪酸甲酯分析专用色谱柱，如OmegawaxTM柱(聚乙二醇)和SP－2560(强极性氰丙基聚硅氧烷)等，此类柱子价格昂贵，且应用范围较窄。本文以37种脂肪酸甲酯混标标准品为研究对象，选用30m长的Rtx－wax石英毛细管色谱柱作为分离柱，采用气相色谱－氢火焰离子化检测器(GC－FID)对其色谱分离条件进行选择，最终确定了一种分离效果较好的色谱条件。在该分离条件下，选用同一根色谱柱，通过气相色谱－质谱联用仪(GC－MS)对37种脂肪酸甲酯做定性分析，确定了37种脂肪酸甲酯在Rtxwax色谱柱上的出峰顺序。在此实验基础上，采用Steric and Electronic Descriptors(SEDs)表征脂肪酸甲酯的三维分子结构信息，运用SPSS(version 16.0)软件进行逐步回归分析，得到预测脂肪酸甲酯色谱保留时间的定量结构－色谱保留相关(QSRR)模型，同时采用留一法(Leave－One－Out，LOO)交互检验(Cross－Validation，CV)和外部验证的方法对所建模型的稳定性和预测能力进行分析和验证，均取得了较好的结果。本工作希望可以为脂肪酸的分析鉴定工作提供一条新途径。

表1 SEDs参数名称及其简写Table 1 SEDs parameter names and their abbreviations

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

37种脂肪酸甲酯混标标准品 上海安谱科学仪器有限公司;正己烷 纯度≥95.0%，色谱纯，天津市光复精细化工研究所。

GC/MS联用仪 型号7890A/5975C，附FID检测器，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸甲酯混标溶液的制备 将25mg的37种脂肪酸甲酯混标标准品溶于2.00mL正己烷溶剂，在样品瓶中密封，冷藏待用。

1.2.2 GC/MS测定条件 色谱条件:色谱柱:Rtxwax石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.5μm);进样口温度:250℃;柱流量:0.60mL/min;升温程序:50℃保持2min，以5℃/min升到140℃，保持10min，再以1℃/min升到160℃，保持10min，再以1℃/min升到180℃，保持10min，再以1℃/min升到200℃，保持10min，再以1℃/min升到220℃，保持10min，然后以 2℃/min升到 230℃，保持 30min;检测器(FID)温度:250℃;检测器气体:氢气 40mL/min，空气450mL/min，尾吹氦气30mL/min;进样量:0.2μL;分流比:10∶1。

质谱条件:电子轰击离子源;离子源温度230℃;电子能量70eV;质量扫描范围m/z 15～500;接口温度为280℃，四极杆温度为150℃。

1.3 SEDs参数计算方法

本文采用 StericandElectronicDescriptors(SEDs)参数来表征脂肪酸甲酯的分子结构信息，该参数能够全面反映三维分子结构的大小、形状、对称性、拓扑特性及电荷情况等，具体的SEDs参数见表1［6－7］。SEDs 参数由能量最小的分子计算获得，先利用ChemDraw Ultra(version 8.0)软件勾画脂肪酸甲酯的分子骨架，然后在Chem3D Ultra(version 8.0)软件中，采用MM2方法和MOPAC软件包进行分子最小能量优化，最后计算出37种脂肪酸甲酯的 SEDs参数。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱分离条件的选择

由于待分离的37种脂肪酸甲酯存在多种异构体，在选择色谱柱时，应综合考虑脂肪酸甲酯的碳原子数、不饱和度以及双键的位置等多个因素。对于同分异构体及碳数相同、双键个数不同的物质，在非极性柱上很难分开;另外考虑到脂肪酸甲酯分析专用柱多为极性固定相，因此，本实验选用强极性的Rtx－wax(聚乙二醇)色谱柱分离37种脂肪酸甲酯。又由于待分离的37种物质，沸程较宽，且有些化合物的沸点比较接近，故采取多步程序升温的方法，且升温速率尽量小，以便沸点接近的化合物能够很好的分离;同时对载气流速进行考察，最终确定的同时分离37种脂肪酸甲酯的色谱条件如1.2.2节中所述，在此条件下，达到了较好的分离效果，且峰形较好。得到的37种脂肪酸甲酯的气相色谱图见图1。

2.2 SEDs参数与脂肪酸甲酯气相色谱保留时间的相关性研究

2.2.1 模型建立 本文中用于建模的37个脂肪酸甲酯的气相色谱保留时间均来自于笔者实验所得。

首先计算出37个样本的SEDs参数，借助多元线性回归(MLR)方法对37个脂肪酸甲酯的SEDs参数和tR(exp)进行相关性研究，采用SPSS(version 16.0)软件进行逐步回归分析，筛选出最优变量。建立定量结构－保留关系(QSRR)模型，采用留一法(LOO)交互检验(CV)对所建模型进行验证，观察模型相关系数(R)、标准偏差(SD)、留一法(Leave－One－Out，LOO)交互检验相关系数(RCV)、标准偏差(SDCV)随引入变量数的增加而变化的情况。为控制模型稳定性和消除变量间共线性的影响，对每步变量进行方差膨胀因子(VIF)［8］计算。VIF=(1－R2)－1，式中 R为某自变量与其它变量相关程度(经自由度校正)。VIF值为1.0，表示各变量间无相关性;VIF值在1.0～10.0之间，表示变量间无明显共线性，相关方程可接受。逐步回归分析及变量膨胀因子(VIF)计算结果见表2。

图1 37种脂肪酸甲酯的气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of 37 fatty acid methyl esters

从表2中可以看出，逐步回归分析中，当选用变量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW 建模时，相关系数R最大，标准偏差SD最小;且留一法交互检验过程中，同样是选入变量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW建模时，RCV值最大，SDCV值最小。而为了保证模型稳定性及消除变量共线性，要求模型中各变量VIF不大于10，满足这一条件的有模型2和模型6，其中模型2中的R、SD、RCV和SDCV均较大，综合分析，最终以模型6为最佳模型。所见QSRR模型如M1:

交互检验:RCV=0.9951，SDCV=4.9251，FCV=789.1953

其中，N为回归样本数，m为变量个数，R为相关系数，SD 为标准误差，F为 Fisher检验值，RCV、SDCV、FCV分别为留一法交互检验的相关系数、标准误差和Fisher检验值。

模型M1的相关系数R=0.9990，留一法(LOO)交互检验(CV)的相关系数RCV=0.9951，与建模时的相关系数R很接近，二者均接近1，说明所建模型的稳定性较好［9］。建模时引入的变量参数及保留时间见表3。另外使用模型M1对37种脂肪酸甲酯的气相色谱保留时间进行预测，并将预测值对实验值的相关情况及残差分布散点图分别绘于图2、图3中。

图2 MLR模型预测值、留一法交互检验预测值与实验值相关性Fig.2 Plot of estimated values，observed ones of Leave－One－Out，LOO and observed ones

图3 MLR模型预测值、留一法交互检验预测值的误差分布Fig.3 Plot of Err EST vs.N

从图2中可以看出，模型预测值与实验值符合的较好，留一法交互检验的预测值与实验值的线性相关性较好，具体表现为图2中样本均匀分布在过原点的45°直线周围。图3显示，模型预测值误差大多数点均匀分布在±2SD之间，留一法交互检验预测值误差基本上均匀分布在±2SDCV之间。

表2 逐步回归及变量膨胀因子值Table 2 The results of stepwise regression and VIF

表3 模型中引入的变量及37种脂肪酸甲酯保留时间(tR)的实验值、预测值Table 3 The introduced variables and observed values and predicted ones of 32 kinds of fatty acid methyl esters

2.2.2 模型验证 在定量构效关系的研究中，对所建模型的外部预测能力和真实有效性进行验证是非常重要的一部分。目前广泛使用的一种模型验证方法是留一法(LOO)交互检验(CV)。然而Tropsha等人［10］的研究结果表明:模型的外部预测能力与RCV值的大小并没有明显的相关性，而是采用外部样本(即测试集)预测值的相关系数Q2ext来衡量:

式中:yi为测试集中样本的实验值;¯yi为测试集样本的预测值;¯ytr为训练集样本实验值的平均值。

为了验证模型对外部样本的预测能力，将上述37个样本分为两组，按照大约三分之一的样本作为测试集，大约三分之二作为训练集，从第一号样本开始，每隔2个取一个样本作为测试集，这样得到25个样本作为训练集(Training Set)，12个样本作为测试集(Test Set)。测试集样本在表3中用“*”号标出。对训练集中的25个样本建模，采用逐步回归进行变量筛选，结合变量的方差膨胀因子VIF值，筛选出四个最优变量(TVcon、SVDe、Windex、Bindex)，借助多元线性回归建立如下QSRR模型(M2):

交 互 检 验:RCV=0.9943，SDCV=5.5598，FCV=433.1412

采用上述12个外部样本(测试集)对所建模型的外部预测能力进行检验，利用公式(1)计算得到=0.9995，进一步表明模型具有良好的稳定性和预测能力。

2.2.3 模型分析 脂肪酸甲酯的定量结构－色谱保留相关模型如M1所示。该模型中引进的四个变量分别为 Windex、Bindex、SVDe、TVcon。由此可知该类型脂肪酸甲酯的气相色谱保留时间与 Windex、Bindex、SVDe、TVcon 有关。

Windex指数是分子骨架中各碳原子间距离总和，其值随分子的增大而增加，随分子的支化程度增加而减小。Windex值的大小反映了溶质分子与固定相作用时色散力强弱的信息。Windex值越大，溶质与固定相之间的色散力越大，保留时间越长，即Windex与脂肪酸甲酯的气相色谱保留时间呈正相关。

Bindex指数是建立在分子图的距离矩阵基础上而构造产生的，对不饱和键给予区分，反映了分子的大小和形状等结构信息［11］。从表3中可见，随着碳数的增多保留时间基本呈上升趋势，其原因是溶质分子碳原子数越多，与固定相接触面积越大，色散力越大;当碳链相同时，Bindex值是相同的，但保留时间却随着饱和度的增大而增大。其原因可能是在不饱和程度增大的过程中，虽然极化力和诱导力是增大的，但因C=C相对于C－C来说，键长缩短，导致色散力减小。综合多种因素的共同影响，模型中Bindex系数为负值是可以理解的。

SVDe为溶质分子中所有原子点价之和［12］，包含了溶质分子与固定相作用时色散力和诱导力的信息，溶质分子色谱保留时间随其SVDe值的增大而增大，这与模型中SVDe的系数为正值是一致的。

TVCon 反映分子的电子结构信息［13－15］。TVCon值越小，表明分子不饱和度越大，诱导力和取向力随之增大，溶质分子的色谱保留时间也就越长。模型中，TVCon系数最小，表明TVCon对脂肪酸甲酯的色谱保留时间贡献较小，并不是主要的影响因素。

在所建模型M1中，Windex系数最大，说明该极性固定相上，分子体积对脂肪酸甲酯化合物色谱保留时间的影响起主要贡献。1、2、3号化合物由于结构简单，分子体积小，在极性固定相上的误差较大是正常的。

3 结论

对于37种脂肪酸甲酯的分离，通常使用脂肪酸甲酯分析专业色谱柱，这类色谱柱价格昂贵，普通实验室不易实现。本工作选用30m长的Rtx－wax石英毛细管色谱柱，就能对37种脂肪酸甲酯取得较好的分离效果。Rtx－wax在一定程度上可以取代脂肪酸甲酯分析专用色谱柱，避免使用价格昂贵脂肪酸甲酯分析专用色谱柱，大大节约了实验成本，实际应用性较强。QSRR研究结果表明，SEDs参数可以较好地表征脂肪酸甲酯类化合物的分子结构特征，采用SEDs建立的QSRR模型具有较好的稳定性和预测能力，可以较好地预测该类化合物的气相色谱保留时间，该方法为植物油脂中脂肪酸的分析工作提供了一定的理论依据。

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