响应曲面法提取温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的工艺优化

曾东慧，张 俊 ，陆胜民

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004;2.浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江杭州310021)

温州蜜柑(Satsuma mandarin)是柑橘罐头加工的主要原料。我国柑橘罐头占世界橘子罐头总产量的75%以上，加工后剩余大量的果皮，除少量加工成陈皮外，大部分作为废弃物填埋，造成环境污染和资源浪费［1－2］。温州蜜柑果皮中富含多种类胡萝卜素，其中β－隐黄素的含量是其它柑橘品种的20～30倍，具有减少黑色素的生成，预防肝脏疾病、癌症、骨质疏松症、肥胖等功能，是目前研究的热点［3－6］。类胡萝卜素为脂溶性，目前对柑橘果皮中类胡萝卜素的提取一般采用石油醚、丙酮、乙酸乙酯、石油醚与丙酮的混合液［7－8］等有机溶剂提取。然而有机溶剂的残留、难以回收及环境污染等问题一直限制着提取产物的使用，带来较多的食品安全和环境污染问题。超声波可使溶剂产生空化效应，空化泡破裂形成的爆破冲击力可打破细胞壁，使溶剂很快渗透到细胞内部。超声波辅助提取温州蜜柑果皮中的类胡萝卜素比机械辅助提取缩短提取时间、提高提取率，且避免了因高温提取对功能成分分子结构的破坏［8－9］。响应曲面法是一种优化提取工艺条件较好的方法，徐媛等［10］以石油醚为提取溶剂，通过响应曲面法优化红葡萄柚中番茄红素的最佳提取工艺，可获得最佳工艺参数，与理论值误差较小，能够为进一步实验研究提供理论依据。为了提高天然类胡萝卜素的应用，熊科等［11］采用超声波强化无水乙醇提取胡萝卜素干粉中β－胡萝卜素，而通过乙醇提取柑橘果皮中的类胡萝卜素在国内外还未见报道。本研究以罐头加工后废弃的温州蜜柑果皮为实验材料，采用以超声波辅助强化提取醇溶性的类胡萝卜素，通过响应面分析(response surface methodology，RSM)评估影响超声波辅助提取温州蜜柑果皮类胡萝卜素的关键因素，以此得到最佳提取工艺条件和参数，为柑橘罐头加工后的温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的安全有效生产提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

温州蜜柑果皮 浙江台州第一罐头厂生产罐头后的废弃果皮，经阴干后粉碎至60目以上备用;甲醇、甲基叔丁基醚 色谱级，TEDIA天地试剂公司，美国;β－胡萝卜素标准品 sigma公司，美国;2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、石油醚、丙酮、95%乙醇 国产分析纯。

Waters 2690型高效液相色谱仪 美国;UV 1800型紫外分光度计 岛津公司，日本;RE 52－99型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;KQ 500BD型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司，中国。

1.2 实验方法

1.2.1 提取溶剂的比较 取干燥后的温州蜜柑果皮样品，按相应的料液比分别加入丙酮、石油醚、丙酮∶石油醚 =2∶1(简称，混合液)、95%乙醇，30℃下超声波提取8min。其中乙醇提取液，用石油醚萃取，上层为含类胡萝卜素的溶液。紫外－可见分光光度法测定不同提取液最大吸收波长，并以β－胡萝卜素计作标准曲线计算相应溶剂提取类胡萝卜素的含量。

1.2.2 两种溶剂提取温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的HPLC分析比较 取30mL提取液旋转蒸发干燥后，用30mL石油醚(含 0.1%BHT)复溶后，加 30mL 10%KOH－甲醇溶液皂化过夜。皂化液加入20mL 10%NaCl溶液后，用石油醚溶液(含 0.1%BHT)完全萃取。上层萃取液用蒸馏水反复洗至中性后，加入适量的无水硫酸钠干燥过滤后，35℃旋转蒸发。样品溶于5mL甲醇∶甲基叔丁基醚(MTBE)=1∶1溶液，0.45μm 有机膜过滤［12］。

HPLC检测条件，色谱柱:YMC C30 Carotenoid S－5柱(YMC，250mm × 4.6mm，5μL)，柱温，26℃;检测波长，450nm;流动相，A 甲醇∶MTBE∶水 =81∶15∶4;B 甲醇∶MTBE∶水 =6∶90∶4，梯度洗脱 90min 内，A 泵由100%降至0%，B泵由0%升至100%;流速为1mL/min。

1.2.3 单因素实验 选择超声功率(200～400W)、超声时间(0～12min)、超声温度(25～45℃)、料液比(1∶10～1∶50)、提取次数(1～3 次)作为考察因素，按照1.2.1节的方法提取温州蜜柑果皮中的类胡萝卜素，以类胡萝卜素的提取含量为指标进行单因素实验。

1.2.4 超声波提取响应曲面的实验 利用 Box－Behnken的中心组合实验设计原理，在单因素实验基础上，确定响应面设计中每个因子的适宜范围。选取料液比、提取温度、提取时间3个主要影响因素为自变量，因素水平及编码值见表1。

1.2.5 标准曲线的制作 分别以石油醚、丙酮、石油醚∶丙酮=2∶1(简称，混合液)的溶剂精确配制40mg/L的β－胡萝卜素标准溶液，稀释成 1、2、3、4、5mg/L，450nm处测定吸光值3次，取平均值。以β－胡萝卜素质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

温州蜜柑果皮中类胡萝卜素含量:

式中:提取液浓度通过吸光值和1.2.5中的标准曲线计算而得，并换算成μg/mL。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of the test

1.2.6 类胡萝卜素提取率计算 将温州蜜柑果皮采用95%乙醇提取数次至提取液为无色时，合并提取液。采用1.2.1测定95%乙醇提取液的方法测定含量，并以此含量作为完全提取果皮中类胡萝卜素的含量Y总类胡萝卜素。温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的提取率计算公式如下:

1.3 数据处理

实验数据采用Excel处理，其结果用平均值表示。柱形图和折线图采用OriginPro 7.5进行绘制。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

通过实验以β－胡萝卜素质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制各溶剂溶解所得的标准曲线如下:

石油醚溶剂:y=0.28124x，R2=0.99956

丙酮溶剂:y=0.27387x，R2=0.99978

混合液溶剂:y=0.25710x，R2=0.99983

其中y为吸光值，x为β－胡萝卜素质量浓度/(mg/L)。结果表明，β－胡萝卜素在质量浓度1～5mg/L范围内与吸光值呈良好的线性关系，β－胡萝卜素为现配现用。

2.2 乙醇等溶剂对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

从图1可知，丙酮∶石油醚=2∶1的混合液和乙醇提取温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的含量较高，而石油醚和丙酮提取的含量较低。柑橘果皮中的类胡萝卜素大多为含氧型类胡萝卜素，如叶黄素、玉米黄素、β－隐黄素等，其极性比不含氧型类胡萝卜素的极性强。根据溶剂相似相溶的原理，柑橘果皮中的类胡萝卜采用极性较强的非极性溶剂提取较为合适。此外，石油醚与丙酮渗透细胞的能力较差，类胡萝卜素不能较好地从细胞中释放，从而提取率较低。乙醇对细胞壁的渗透能力强，能够较好地渗透入细胞壁，从而使类胡萝卜素较好地释放而溶解于溶剂中。

图1 不同溶剂对温州蜜柑果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.1 Effect of different solvents on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

从混合液和95%乙醇提取类胡萝卜素的HPLC图谱(图2)中可知，两种溶剂提取得到的类胡萝卜素主要组成是一样的，说明两种溶剂均能使柑橘皮中类胡萝卜素较好地溶解。由于乙醇无毒、便于回收，残留溶剂对人体健康危害少，且可安全应用于食品等行业，因此本文采用乙醇对温州蜜柑果皮中类胡萝卜素进行提取。

图2 温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectrum of carotenoids in the mandarin peel

2.3 超声波功率对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

从图3可知，随着超声波功率的加大，样品中类胡萝卜素提取含量先升高而后降低，当超声波功率为250W时，类胡萝卜素的提取含量最高。超声波辅助提取有助于液质传动，但其功率过大会使类胡萝卜素发生降解。因此，本文选用超声波功率为250W。

2.4 超声波温度对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

图4表示超声波温度对果皮类胡萝卜素提取含量的影响。在一定范围内，温度升高能够提高类胡萝卜素的提取含量。温度为35～40℃时提取含量最高，而45℃时，果皮中类胡萝卜素的提取含量下降，可能是较高的温度虽然可使柑橘皮细胞膜的通透性改变，使类胡萝卜素得到较好的释放，但其也会发生降解，因此温度不宜过高，这与类胡萝卜素的提取温度不能超过35℃的研究报道［13］一致。

图3 超声功率对果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

图4 超声温度对果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.5 超声波时间对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

图5表明，随着超声提取时间的延长，提取含量会持续增加，而后趋于稳定。超声提取初期随着时间的延长，细胞破碎程度增大，细胞内部的类胡萝卜素开始向外扩散，使得溶剂中类胡萝卜素的含量迅速升高。当超声时间达到10min左右时，提取液中类胡萝卜素的液质传动达到平衡值，因而其含量趋于稳定。

图5 超声时间对果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.6 料液比对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

从图6可知，随着料液比增加，提取含量先增加，而后趋于稳定。溶剂用量越多，传质动力越大，扩散到溶剂里的类胡萝卜素就越多。考虑到料液比太高会增加提取成本，且给后续的浓缩工作带来不便。因此，本实验选择料液比1∶30g/mL左右较为合适。

图6 料液比对果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.6 Effect of material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.7 提取次数对果皮类胡萝卜素提取含量的影响

以乙醇作为溶剂，超声功率为250W，超声温度为35℃，超声时间为9min，料液比为1∶30g/mL，考察各提取次数中类胡萝卜素的提取效果。由图7可知，通过第一次提取后，果皮中85%类胡萝卜素都得到了回收，而第2、3次提取仅存少量的类胡萝卜素，为了节约溶剂的使用量，节约成本，及后期工作量，综合考虑采用一次提取。

图7 提取次数对果皮类胡萝卜素提取含量的影响Fig.7 Effect of extraction times on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.8 响应曲面优化提取工艺

2.8.1 实验结果及方差分析 以提取含量为响应值，在单因素实验结果上，利用Box－Behnken响应曲面法设计三因素三水平实验，结果见表2。将所得的实验数据采用Design Expert 8.0.6 Trail软件进行多元回归拟合，得到以类胡萝卜素提取含量对提取料液比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)的二次多项回归方程:

式中的料液比(X1)、温度(X2)、时间(X3)在设计中均经量纲线性编码处理，因此方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。

为了检验方程的有效性，对温州蜜柑果皮中类胡萝卜素提取含量的数学模型进行方差分析。由表3可知，一次项中，料液比(X1)、提取时间(X3)的影响显著(p＜0.05)，提取温度(X2)的影响不显著(p＞0.05)。交互项均不显著(p＞ 0.05)，而二次项中，的影响均显著(p＜0.05)。通过对回归方程的方差分析，可得绝对系数R2=0.9322，变异系数为5.34%，表明该方程对实验拟合情况较好，实验误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。同时，经分析可知失拟项为p=0.0697 ＞0.05，未达到显著水平，表明实验设计合理，该模型能较好地描述变量与提取含量之间的关系。

表2 Box－Behnken响应曲面法实验设计及结果Table 2 Central composite design and its result of the three variables using Box－Behnken response surface method

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

2.8.2 响应面分析与优化 通过模型方程所作的响应曲面图及其等高线，结果见图8～图10，料液比和温度的相互作用较显著。等高线的形状可反映出交互作用的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则反之。

图8 超声温度与料液比对果皮类胡萝卜素提取含量影响的响应曲面和等高线Fig.8 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction temperature and material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

图9 超声时间与料液比对果皮类胡萝卜素提取含量影响的响应曲面和等高线Fig.9 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction time and material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

图10 超声时间与温度对果皮类胡萝卜素提取含量影响的响应曲面和等高线Fig.10 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction time and ultrasonic temperature on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

通过软件分析得最佳提取条件为，X1=1∶34.48，X2=35.93，X3=8.63，在此条件下提取类胡萝卜素含量的理论值为349.947μg/g。经过转换后得到温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的最佳提取条件为料液比1∶35g/mL，温度36℃，时间9min，通过实验得温州蜜柑果皮中类胡萝卜素的实际提取含量为351.25μg/g，其与理论值的相对误差较小，提取率为85.86%，较乙醇静置提取1h，其单次提取含量提高了22%，提取时间缩短了85%。因此利用响应曲面法优化温州蜜柑中类胡萝卜素的提取工艺是有效可行的，提取率高，具有实际应用价值。

3 结论

乙醇安全无毒、便于回收，提取后残留量少，提取类胡萝卜素的含量高，因此乙醇用于柑橘皮中类胡萝卜素的提取是可行的。

从超声波辅助对温州蜜柑果皮中类胡萝卜素提取工艺的单因素和响应曲面法分析，得到了超声辅助乙醇提取类胡萝卜素的最佳工艺条件为:采用95%乙醇溶剂进行单次提取，超声功率250W，料液比1∶35g/mL，温度36℃，时间9min时，测得类胡萝卜素的提取含量为351.25μg/g，提取率为85.86%，较乙醇溶液静置提取1h，其含量提高了22%，提取时间缩短了85%。该研究为罐头加工后的温州蜜柑皮中类胡萝卜素的安全有效生产提供了参考。

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