重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

王 华，文 一，于寒松，朴春红，王玉华，刘俊梅，胡耀辉，*

(1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028000;2.吉林农业大学食品学院，吉林长春130118;3.环境保护部环境规划院，北京100012)

β－环糊精葡萄糖基转移酶(β－CGTase)属于α－淀粉酶家族，可以作用于淀粉的葡萄糖单位通过α－1，4－糖苷键连接而生成 β－环糊精(β－CD)。β－CD的化学结构具有非极性空穴和外亲水的特点，常被用作分子胶囊和乳化剂，广泛应用于食品、医药、化妆品、农药等领域［1－2］。

β－CGTase是催化淀粉发生环化反应生成β－CD的关键酶，但是酶法生产由于酶活性的影响使得产率低［3］。近年来，基因工程定点突变技术广泛应用于酶的体外改造中，通过改变酶的基因序列来改变酶与底物的结合能力，从而改变酶的活性。Shin Hyun－Dong等［4］人利用定点突变技术将 β－CGTase基因中W652突变成G，结果表明酶的环化活性增强而水解及偶合活性降低。通过对来自B，circulans 251中的环糊精转移酶进行突变Ala230Val，使该酶的水解活性提高而环化活性降低［5］。重叠延伸 PCR技术(overlap extension PCR)是1989年Horton等人建立的一种PCR扩增方法［6］，它通过寡聚核苷酸链之间相互重叠的部分搭桥，互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的DNA基因片段的方法。重叠延伸PCR技术可以准确、高效地扩增DNA片段，尤其在进行定点突变时可以提高突变效率，并且不受突变位置及突变类型的限制［7］。本实验通过在SWISSMODEL上建模，根据蛋白质三维结构，考虑到β－CGTase属于α－淀粉酶家族，其基因序列C端的保守区是与淀粉酶的特异性和稳定性有关，不影响酶活性质，因此将N端典型保守区域氨基酸残基进行改变，从而改变突变位点的疏水性及其空间结构［8］，分析得到β－CGTase保守区内可能影响到酶环化活性的二个关键位点 Y127和 R254，采用重叠延伸PCR技术进行定点突变，为β－CGTase环化活性的提高提供研究基础。

1 材料与方法

表1 重叠延伸PCR的引物Table 1 Primer pairs of overlap extension PCR

表2 引物配对和PCR产物Table 2 Primer pairs and production of PCR

1.1 材料与仪器

菌株Escherichia coli BL21(DE3)上海光明乳业有限公司技术中心惠赠;重组表达质粒 pET－28b::CGTase 上述技术中心构建;Primer STAR HS和Taq聚合酶、克隆载体pMD18－T Simple、表达载体pUC－18，T4 DNA连接酶、限制性内切酶 HindⅢ和KpnⅠ 均购自TaKaRa公司;氨苄青霉素贮存液 氨苄青霉素 北京鼎国，用无菌超纯水配成100mg/mL，分装，－20℃冻存，使用时每1mL培养基加入lμL，终浓度为100μg/mL;常规化学试剂 均为国产分析纯试剂;液体 LB 培养基［9］1.0% 胰蛋白胨，1.0%NaCl，0.5%酵母浸出物，加蒸馏水充分溶解后，定容至1L，分装，高压蒸汽灭菌118℃，20min。

PCR扩增仪 ABI，Applied Biosystems;凝胶成像系统 DNr MiniBis pro。

1.2 实验方法

1.2.1 重叠延伸PCR 扩增原理［10］如图1所示，F1和R2与原模板完全匹配，F2和R1是引入的突变位点，并且具有12个以上相匹配的互补碱基。以ORF为模板，用引物F1和R1，F2和R2分别扩增得到ORF－1和 ORF－2，再以 ORF－1和 ORF－2 混合物为模板，用引物F1和R2扩增得到突变的基因序列。

图1 重叠延伸PCR原理Fig.1 Principle of overlap extension PCR

1.2.2 引物 根据 β－CGTase基因和2个突变氨基酸相应位点及其两侧的碱基序列，用软件 Primer premier 5.0设计一对β－CGTase的引物和2对突变引物，如表1。

1.2.3 PCR 扩增 第一轮 PCR:以质粒 pET－28b::CGTase为模板，根据重叠延伸PCR的反应原理，设定扩增ORF－1和ORF－2片段程序:94℃ 5min;94℃45s，55℃ 45s，72℃ 90s，35 个循环;72℃ 10min;4℃保温。

第二轮PCR:以 ORF－1和 ORF－2混合物为模板，扩增得到突变的基因片段程序:94℃ 5min;94℃45s，55℃ 45s，72℃ 2min，35 个循环;体系中加入 Taq聚合酶，72℃ 30min;4℃保温［11］。

1.2.4 突变目的基因的鉴定 PCR扩增后，取5μL PCR产物用于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 克隆载体的转化与鉴定 鉴定正确的突变基因使用TIGEN胶回收试剂盒进行PCR产物纯化回收，经过纯化的产物与pMD18－T Simple载体连接。利用热击法将克隆载体转化到E.coli DH5α中，在含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行液体扩大培养，经过菌液PCR检测及质粒双酶切鉴定片段大小正确后，将阳性菌株送上海生工进行基因测序。

1.2.6 原核表达载体的构建 将已确认的pMD18－T重组质粒和pUC－18表达载体用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ分别进行双酶切，纯化回收目的基因和表达载体并使用T4 DNA连接酶将其连接，连接产物转化E.coli BL 21(DE3)，在含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选，得到阳性菌株，进行酶切鉴定和DNA序列测定。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增结果

2.1.1 第一轮PCR:ORF－1和ORF－2片段扩增 用适当稀释的质粒pET－28b::CGTase为模板，以表2所示的引物进行配对PCR扩增，分别获得相应的PCR产物。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果与预计相符，并且没有非特异性条带，结果如图2所示。

2.1.2 第二轮PCR突变基因片段扩增 第一次获得的各突变体的ORF－1和ORF－2基因片段纯化后经适当稀释等量混合作为模板，用引物F1/R2进行扩增，经1.0%琼脂糖电泳检测，产物大小均为2139bp，且无非特异性条带，结果与预计相符，如图3。

2.2 PCR产物鉴定

与T－vector连接后转化到 E.coil DH5α 中，经过菌液PCR鉴定，结果正确后再提取质粒，用HindIII和Kpn I进行双酶切(图4)，酶切片段大小正确，再进行测序鉴定。

图2 不同突变体的ORF－1和ORF－2片段扩增电泳分析Fig.2 Electrophoresis of ORF－1 and ORF－2 amplified fragment of different mutants

图3 不同突变体的突变基因片段扩增电泳分析Fig.3 Electrophoresis of the amplified fragment of different mutants

图4 突变体双酶切鉴定Fig.4 Restriction enzyme digestion of the mutants

2.3 克隆载体的测序分析

利用clustalx1.81对原基因β－CGTase蛋白序列和二个突变体Y127F，R254F的蛋白序列进行多序列比对，所获得突变基因是预先设计的定点突变(图5)，表明β－CGTase突变体构建成功同时也说明了overlapPCR技术是一种简便且有效的定点突变方法。

2.4 原核表达载体的构建

图5 β－CGTase基因序列与突变基因序列多重序列比较Fig.5 Multiple alignment of the amino－acid sequences of β－CGTase and mutants

经上海生工测序，测序结果与克隆载体测序一致，表明突变的目的基因已插入到pUC18表达载体中，成功构建了原核表达载体。

3 结论

3.1 本研究采用重叠延伸PCR技术成功地将β－CGTase基因活性中心关键位点的两个氨基酸Y127，R254分别进行定点突变，得到突变体Y127F和R254F，构建出突变重组表达载体，并转化至大肠杆菌中诱导表达，使β－CGTase基因实现了在大肠杆菌中的有活力表达，为后续β－环糊精葡糖糖基转移酶的环化活性提高提供研究基础。

3.2 重叠延伸PCR技术可以将两个DNA片段连接在一下，使其能够在体外进行准确、高效的基因重组，且不需要使用内切酶消化和连接酶处理。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计以及模板的纯度，重叠互补引物3'端与模板作用，5'端与重叠延伸中待融合的DNA片段互补，引物重叠部分应有15～20个碱基，突变的碱基设计在引物的中间部位。除此之外，还要考虑引物Tm值对PCR结果的影响，引物的GC含量对Tm值的影响很大，因此引物设计时尽量降低引物中GC的含量;一个PCR体系中的所有引物的Tm值应该相近，以确保延伸扩增的顺利进行。模板的纯度主要是指第二轮PCR中使用第一轮PCR产物作为模板，因此产物需经过纯化，通常当模板 OD260/OD280 为 1.75～1.80 为最佳。本实验应用Primer premier 5.0软件设计突变引物，突变碱基设计在引物的中间部位，引物重叠部分在15～20个碱基之间，引物GC含量在40%～60%之间，第一轮PCR产物经切胶回收浓度达到50ng/μL做为第二轮PCR反应的模板，经延伸PCR扩增产物测序证实在位点Y127，R254成功地进行了基因突变。

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