高压CO2处理对香蕉果肉中多酚氧化酶活性的影响

汪少华，曹清明 ，余元善，徐玉娟，肖更生，吴继军，唐道邦

(1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004;2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东广州510610)

近些年来，中国香蕉产业发展迅猛，目前已成为南亚热带地区的最大宗水果。目前香蕉主要以鲜食为主，深加工较少，其主要原因是香蕉在剥皮、切片、打浆榨汁等过程中极易产生组织褐变现象［1］。香蕉加工中的酶促褐变主要是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)引起的［2］。为了抑制香蕉果肉中多酚氧化酶引起的褐变，传统的方法是通过热加工或一些化学护色剂(柠檬酸、亚硫酸盐和抗坏血酸等)来钝化或抑制香蕉果肉中多酚氧化酶活力。热加工易使产品产生蒸煮味，并对香蕉中的营养成分破坏较大，而护色工艺本身不能完全钝化香蕉果肉中的多酚氧化酶，且护色剂的添加容易产生一系列的食品安全问题，对产品的风味也有一定的影响［3－4］。因此，寻找新的加工方法来钝化香蕉果肉中的多酚氧化酶，并减少对其营养成分的破坏是提高香蕉产品品质，实现高附加值的有效途径。高压二氧化碳技术是目前发展较快的一种新型的非热加工技术，它克服了热加工造成的种种弊端［5－6］。研究表明，在一定的压力下(3～30MPa)，二氧化碳对食品中微生物具有杀灭效果，同时能使部分酶钝化。目前，关于高压二氧化碳技术对食品中微生物的灭菌效果研究较多，但对食品内源酶钝化作用的研究相对较少。几项研究表明，高压二氧化碳技术处理能有效降低多种酶的活性，并认为酶活性的降低与酶二级结构中α－螺旋结构变化有关［7－9］。Ishkawa 等［10］发现，在25MPa、35℃、30min的超临界二氧化碳的处理下，脂肪酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶以及葡萄糖氧化酶的活性分别为处理前的62.9%、31.3%、37.6%、12.4%，同时观察到处理后α－螺旋结构发生了变化，可能是这种变化导致了酶活性的变化。目前，评价高压CO2处理在香蕉果肉钝酶护色方面的研究还未见报道。本文比较了CO2压力、温度和处理时间对香蕉果肉中多酚氧化酶钝化的影响，并且采用二次回归正交旋转组合设计优化了高压二氧化碳对香蕉果肉中多酚氧化酶的钝化工艺，为高压CO2处理在香蕉果肉钝酶护色研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉 属于广州本地蕉品种，表皮黄色，购自当地农贸市场;99.5%二氧化碳气体 广州龙奥气体设备有限公司;其它化学试剂均为国产分析纯。

DJ12B－A11打浆机 九阳打浆机;B－25高速分散均质机 上海标本模型厂;UV－1800紫外－可见分光光度计 日本岛津公司;5702R型高速冷冻离心机 德国eppendorf公司;50MPa－11B高压二氧化碳处理设备 杭州华黎泵业有限公司研制。

1.2 实验方法

1.2.1 香蕉果肉的高压CO2处理方法 将切成长1cm小段的香蕉果肉(约100g)，置于高压CO2装置的样品处理室中。调节处理室的温度和CO2的压力到设定值(约5～6min)后，恒温恒压保持一定的时间，缓慢释放CO2到正常大气压(约5～6min)后，取出样品用于后续的多酚氧化酶活力测定实验。

1.2.2 香蕉果肉中残留的多酚氧化酶活力测定 取处理后的样品香蕉果肉(100g)与250mL的0.1mol/L磷酸钠盐缓冲液体(pH5.5)混合，同时添加3.5g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)和3.5mLTriton X－100;放置在打浆机中中速处理3min后，转入500mL烧杯中高速均质5min;将上述均质后的样品于4℃下10000×g，离心10min，上清液即是香蕉果肉中残留的多酚氧化酶液。多酚氧化酶活力测定采用邻苯二酚法［11］。具体为:20μL待测样品酶液、2mL 50mmol/L的磷酸钠盐缓冲液(pH7.0)和0.5mL 50 mol/L邻苯二酚水溶液充分混合，反应体系温度为30℃，立即置于分光光度计中，测定并监控OD420值的变化，以每分钟ΔOD420变化0.001所需的酶量为一个酶活力单位。结果以残留的多酚氧化酶活表示，多酚氧化酶活残留率(%)=处理后的酶活力(A)/处理前的酶活力(A0)×100。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同CO2压力对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 香蕉果肉分别在5、10、15、20、25MPa的高压CO2下处理20min(55℃)后，测定其残留的多酚氧化酶活。

1.2.3.2 不同温度对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 香蕉果肉分别在30、40、50、55、60℃下经20MPa的高压CO2处理时间20min后，测定其残留的多酚氧化酶活。

1.2.3.3 不同处理时间对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 香蕉果肉在20MPa的高压CO2处理(55℃)下分别处理 0、20、40、50、60、80min 后，测定其残留的多酚氧化酶活。

1.2.4 钝酶条件的优化 在单因素实验基础上，以降低香蕉果肉中残留的多酚氧化酶活为指标，采用二次回归正交旋转组合设计方法优化对高压CO2处理钝酶影响最显著的因素(CO2压力、温度、处理时间)，表1列出了各因素的水平编码表。

表1 因素水平编码表Table 1 Code of factors and levels

1.3 数据分析

采用 统 计 分 析 软 件 DX6Trial［12－13］对 数 据 进 行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同CO2压力对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 由图1可知，在55℃、处理时间为20min的条件下，香蕉果肉中残留的多酚氧化酶活随着压力的增大而快速降低。在15MPa以下时，随着CO2压力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的钝化率显著提高，而在15MPa以上时，随着CO2压力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的钝化率并没有显著提高(p＞0.05)。

图1 不同压力的高压CO2处理香蕉果肉后其多酚氧化酶活残留率Fig.1 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various pressure of high pressure carbon dioxide at 55℃for 20 min

2.1.2 不同温度对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 由图2可知，随着温度的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的钝化速率明显提高，50℃是高压CO2钝化香蕉果肉中多酚氧化酶的关键转折点，当温度低于50℃，高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效率一般，但当温度高于50℃后，高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效率显著提高。例如，香蕉果肉在60℃下经20MPa的高压CO2处理时间20min后残留的酶活力少于10%，而香蕉果肉在30℃同样的压力和时间处理下，果肉中的多酚氧化酶几乎没有钝化。

图2 香蕉果肉经不同温度的高压CO2(20MPa，20min)处理后其多酚氧化酶活残留率Fig.2 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various temperature of high pressure carbon dioxide at 20 MPa for 20 min

2.1.3 处理时间对香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的影响 由图3可知，香蕉果肉55℃经20MPa的高压CO2处理20min后，多酚氧化酶的残留率急剧下降，为21.5%，若继续延长处理时间到80min后，多酚氧化酶的残留率仅下降到9.8%。所以香蕉果肉中多酚氧化酶在高压CO2处理20min时，其多酚氧化酶的残留率下降呈关键转折点，即处理20min之前，随着处理时间的延长，多酚氧化酶的残留率呈迅速下降状态，为快速钝化期;当处理20min之后，随着处理时间的延长，多酚氧化酶残留率呈缓慢下降状态，进入缓慢钝化期。

图3 香蕉果肉经高压CO2(20MPa，55℃)处理不同时间后多酚氧化酶活残留率的变化Fig.3 Change of relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide(20 MPa)for 20 min at 55℃

2.2 钝酶条件的优化

综合单因素实验影响结果，选取CO2压力、温度和处理时间对高压CO2处理钝酶影响最显著的因素，确定各因素的上、下限，按二次回归正交旋转组合设计方法确定因素及水平(表1)。采用二次回归正交旋转组合设计将因素水平设计成23个实验组，实验结果见表2。

对表2的数据进行回归分析，得到香蕉果肉中多酚氧化酶的残留率(Y)对温度(X1)、CO2压力(X2)、处理时间(X3)的二次多项回归方程为:Y=0.16－0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.015+0.04+0.022+0.026X1X2+0.013X1X3+0.00675X2X3。

表2 实验设计及结果Table 2 Experiment Design and Results

对该模型进行方差分析，结果见表3。从方差分析结果来看，模型的显著性检验p＜0.01，表明该模型具有显著的统计学意义。模型中 X1、X2、X3、极显著，显著，其它项不显著。对表2的数据进行回归分析，剔除不显著交互作用，回归分析得到Y对X1、X2、X3的标准回归方程为:Y=0.16 －0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.04+0.022。在实验范围内，对于高压CO2处理对香蕉果肉中多酚氧化酶的酶活残留率，一次项系数估计值的绝对值X1＞X3＞X2，说明温度对多酚氧化酶的酶活残留率影响最大，其次是时间，最小是CO2压力。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

最后，通过DX6Trial软件的优化功能及数学求偏导，获得了高压CO2处理后香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率最小响应值及其所对应的因素条件。他们分别是在19.91MPa的高压CO2下于59.33℃处理50min，此时香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率为0.81%。考虑到成本问题及各因素对响应值的影响顺序，选择最优处理条件为压力19MPa、温度60℃和保压时间50min，在此条件下进行验证实验，香蕉果肉的多酚氧化酶活残留率为0.9%，与理论预测值相近。

3 结论

3.1 在香蕉果肉的高压CO2处理钝酶期间，影响香蕉果肉中多酚氧化酶活残留率的因素大小顺序依次是处理温度、处理时间和压力。

3.2 采用二次回归正交旋转组合设计法优化了香蕉果肉的高压CO2处理钝酶条件，并获得相关的回归模型。优化后的香蕉果肉的高压CO2处理钝酶条件是19MPa的高压CO2在60℃下处理50min，处理后香蕉果肉的多酚氧化酶活残留率仅为0.9%。

［1］李玉萍，方佳.中国香蕉产业现状与发展对策研究［J］.中国农学通报，2008，24(8):443－447.

［2］Mowlah G，Takono K，Kamoii.Browing phenomenon by banana polyphenoloxidases［J］.Journal of Japanese Society of Food Science and Technology，1983，30(4):245－251.

［3］Aurore G，Parfaitb B，Fahrasmane L.Bananas，raw materials for making processed food products［J］.Trends in Food Science ＆Technology，2009，20(2):78－91.

［4］滕建文，吴苏才，韦保耀.不同品种香蕉对香蕉粉加工的影响［J］.食品工业科技2007，28(2):88－90.

［5］Zhang J，Thomas A，Davis T A，et al.Sterilization using highpressure carbon dioxide［J］.Journal of supercritical fluids，2006，38(3):354－372.

［6］Garcia－Gonzalez L，Geeraerd A H，Spilimbergo S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods:The past，the present and the future［J］.International journal of food microbiology，2007，117(1):1－28.

［7］Gui F，Wu J，Chen F，et al.Inactivation of polyphenol oxidases in cloudy apple juice exposed to supercritical carbon dioxide［J］.Food Chemistry，2007，100(4):1678－1685.

［8］Pozo－Insfran D，Balaban M O，Talcott S T.Inactivation of polyphenol oxidase in muscadine grape juice by dense phase－CO2processing［J］.Food Research International，2007，40(7):894－899.

［9］Gui F，Chen F，Wu J，et al.Inactivation and structural change of horseradish peroxidase treated with supercritical carbon dioxide［J］.Food chemistry，2006，97(3):490－489.

［10］Ishikawa H，Shimoda M，Yonekura A，et al.Inactivation of Enzymes and Decomposition of α－Helix Structure by Supercritical Carbon Dioxide Microbubble Method［J］.Journal of agricultural and food chemistry，1996，44(9):2646－2649.

［11］Coseteng M Y，Lee C Y.Changes in apple polyphenol oxidase and polyphenol concentrations in relation to degree of browning［J］.Journal of Food Science，1987，52(4):985－989.

［12］Yildiz Zehra.Optimization of the parameters of the magnetic filtration process using response Surface methodology［J］.Transport in Porous Media，2011，90(3):965－975.

［13］袁志发，周静芋.实验设计与分析［M］.北京:高等教育出版社，2000:346－348.