海洋贝类活性肽的研究现状和应用前景

王 晶，吴燕燕 ，杨贤庆

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东广州510300;2.上海海洋大学食品学院，上海201306)

生物活性肽属于小分子物质，具有可以被肠道直接吸收的营养特性，其天然活性、安全性以及高效性一直备受关注。早在2000多年前，我国就有《历代本草》记载了海洋贝类的药用价值。贝类作为我国近海的主要养殖物种，其年产量占我国总养殖量的80%，是一个丰富的天然活性肽资源库。与在市面上用于食品、药品、化妆品以及饲料工业的合成添加剂相比，从贝类中制备的活性肽安全性和效用都很高，因此成为了当前国内外的热门研究课题。

1 贝类活性肽的制备

生物活性肽，是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，又称功能肽。目前研究的海洋贝类活性肽主要有ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、抗肿瘤肽和神经肽等等，关于其制备和功能活性也有许多研究及应用的报道。由于天然贝类活性肽的含量较低，难以实现大批量生产。所以后续发展了水解贝类蛋白来提取功能活性肽的方法，有酸水解、发酵法和酶水解。酸解制备会影响肽的氨基酸组成和二级结构从而破坏其活性，且过程难以控制;发酵法多适用于植物来源的多肽制备，并需要配合活性多肽的化学合成和基因工程修饰等技术;而酶法制备活性肽不但生产成本低、产品安全性高，并且水解进程易于控制，是目前制备活性多肽的主要方法。目前国内外对于贝类活性肽的酶解研究主要集中在扇贝、贻贝、牡蛎和文蛤等近海贝类中。对贝类酶解蛋白的加工报道也是随着生物工程技术的发展而逐渐增多，由单一的单酶解工艺上升为双酶复合酶解和多酶分步定向酶解得变革，相应的也从贝类蛋白中提取出了不同功能的活性肽液。吴燕燕等［1-3］对合浦珠母贝抗氧化肽的酶解制备、分离纯化以及其抗氧化活性进行了系统研究，采用Sephadex G-25分子筛层析法分离得到相对分子量分别为1437.5、833.7、421.9、244.7、89.0、17.4u 六种活性组分，并验证了其抗氧化能力，通过细胞溶血实验、对保湿活性的研究和添加到化妆品中的抗氧化效果验证了贝类抗氧化肽在化妆品领域中具有广阔的应用前景。单一酶水解作用是有限的，有时需要两种酶解复合酶解起到互补的作用切断相对应的特异性肽键，从而提高水解率。张泽等［4］使用单因素实验设计正交优化中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解长牡蛎，并实验酶解产物的还原能力和DPPH自由基清除能力。林娈等［5］通过Q检验法研究了中性蛋白酶和胰蛋白酶的复合比例，再通过正交试验确定以风味蛋白酶二段酶解的最佳工艺参数，从而实现文蛤肉复合酶分布酶解工艺。

2 贝类活性肽的分离纯化

采用酶法水解蛋白质，得到活性肽液。为了进一步制备高纯度的目标活性肽，可以根据各自的特性选择合理的分离纯化方法，能使分子量大小达到1000u以下。

2.1 膜分离技术

膜分离技术是在压力差和浓度差等推动下的透过性膜，以截留相对分子量为指标，借助于膜的孔径大小来筛选肽分子，从而实现肽的分离和纯化。膜分离根据截留的分子量大小可分为微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)。张艳萍等［6］比较了不同截留分子量的超滤膜对紫贻贝酶解物分离所得产物的ACE抑制活性，最后确定了截留分子质量为10ku的超滤膜能将紫贻贝酶解物的ACE抑制率提高到89.42%;黄海等［7］用多种酶对扇贝边进行深度水解后，采用超滤技术除去未水解的蛋白质、细菌和微细颗粒等成分，成功富集了氨基酸和小分子肽。

超滤技术的操作条件温和，活性肽受到温度和pH等因素的影响较小，且处理量大，能避免加入其它溶剂污染分离物。但是超滤膜容易发生不可逆的污堵问题，且不易清洗，需要依具体情况选择反洗或化学清洗处理，长此以往还会造成膜断丝和阀门的损坏。

2.2 色谱法

目前常用于贝类活性肽纯化的方法包括凝胶过滤法(GFC)、离子交换层析法(IEC)、高效毛细管电泳法(HPCE)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等色谱技术。其中凝胶过滤色谱具有实验条件温和以及填料可反复使用的特点，被广泛用于分离纯化水溶性大分子的物质，现较多地联合几种色谱方法使用，取长补短达到更好的纯化效果。杨永芳等［8］采用反相高效液相色谱验证了对贻贝水解物进行超滤、DEAE-sepharose离子交换和Sephadex G-25凝胶层析得到的一个抗肿瘤活性肽段的氨基酸序列为Asp-Leu-Tyr;Jiapei Wang 等［9］用 Sephadex LH-20 凝胶过滤色谱分离纯化得到一种ACE抑制肽，反相高效液相色谱法测定序列为Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，并利用小鼠体外实验得出该肽的半抑制浓度为66μmol/L。

2.3 联用技术

酶解制备的活性多肽并不完全是活性最强的活性肽段的溶液，各肽段间大多具有相似性，所以使用单一的分离纯化方法的效果不够理想。通常需要多种方法联用，一般多用膜技术结合几种色谱技术，随着对活性肽的分离纯化、作用机理以及生理效果研究不断深入，对其纯度和结构研究的要求也相应提高，应要求近些年出现了色质联用，如HPLC串联质谱和电泳与质谱联用。赵听友等［10］将凝胶色谱与高效液相色谱法结合从南海桶形芋螺的毒液中纯化出一种新的毒素BtIIIB，联合氨基酸组成分析、质谱分析和 Edman降解测定 BtIIIB的氨基酸序列为:CCELPCHGCVPCCWP，并用还原法衍生裂解，在MALDI-TOF MS中确定了其二硫键的配对方。Pedro等［11］先用HPLC-MS分离分析多肽混合物，再利用CE技术做进一步的分离纯化实现了多种肽段的分离。

3 贝类活性肽的构效研究

活性肽蕴藏于贝肉蛋白链的功能区内，在母体蛋白链中并不表现其活性，经过水解后才能暴露相关的活性位点。目前对于活性肽的生物活性与其结构之间的关系还不够明确，因此其相关性研究一直是国内外关注的热点。虽然此类的报道不多，但可发现某些肽的活性和结构有一定的普遍性规律，其功能活性与氨基酸的种类及序列密切相关，现对于活性肽构效研究多围绕肽的一级结构、氨基酸组成比例以及肽的构象分析。

3.1 贝类活性肽的分子量与活性的关系

国内外研究报道了一些来自贝类蛋白的功能活性肽的分子量，发现较强活性的功能肽集中在3000u以下。汪秋宽等［12］检测中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蛎的活性肽抗氧化性时，发现两种酶分别作用得到的最强羟自由基清除力的抗氧化肽分子量为1074、735u 以及 1191 和 826u。阎欲晓等［13］利用正交试验优化了三种酶酶解文蛤蛋白的条件，并用Sephadex G-50凝胶柱纯化了达最佳清除率的三种酶解物，结果证明水解液中的抗氧化肽分子量集中在1000u以下。

3.2 贝类活性肽的一级结构与活性的关系

活性肽分子表现出各自较强的活性往往与其自身的氨基酸组成和排序相联系，甚至可以认为一些氨基酸结构的存在决定了肽的功能活性。Won等［14］发酵蓝贝沙司，提取纯化其中的抗氧化肽，检测序列为 Phe-Gly-His-Pro-Lyr。Rajapakse 等［15-16］从乌贼中获得了两种富含Gly和Leu的抗氧化肽，且两种疏水性氨基酸出现频率也较高，进一步研究发现在发酵贻贝沙司中抗氧化肽的活性还与序列中的酸性氨基酸侧链羧基螯合金属离子相关。王日昕等［17］分离纯化厚壳贻贝血清抗菌肽，经过高效液相和气质联用分析抗菌肽的氨基酸序列结构，证实得到的3种抗菌肽N末端与地中海贻贝和紫贻贝抗菌肽具有较高的相似性。

3.3 贝类活性肽的构象与活性的关系

肽的构象包括二级结构、疏水性以及二硫键等对功能肽的活性存在直接的影响。杨林等［18］深入探讨了两种新型人工抗菌肽mytilin-derived-peptide-1(MDP-1)和mytilin-derived-peptide-2活性差异的结构基础，研究结果表明MDP-1和MDP-2均采取了典型的β-发夹结构，其中疏水氨基酸和碱性氨基酸面积差异是造成两者活性不同的原因所在。刘娜等［19］对中国南海新型芋螺毒素的化学合成、活性测定及表达条件进行了初步探讨，中间环节采用两步氧化折叠及HPLC共洗脱证实所测定的α-芋螺多肽折叠主产物的二硫键连接方式为Cys 1-Cys3和Cys2-Cys4。也有学者人工合成贝类抗氧化肽氨基酸序列，通过插入或删除其中的一些序列结构实验其活性的变化。

目前对活性肽的构效关系研究还处于探索阶段，前期研究出的一些活性肽的结构模型仍无法清楚解释活性肽的作用机理。就前期研究来看，对ACE抑制肽、抗氧化肽和抗菌肽的结构与活性关系研究较多。ACE抑制肽一般含有10个以下氨基酸残基，肽链 C 端主要为 Tyr、Pro、Trp、Phe 和 Leu，N 端为 Arg、Tyr、Gly、Val、Ala、Ile 和 Leu，且 C 端结构对肽的活性影响较N端强，该结果符合Cheung H S(C端含有芳香族氨基酸)和Cushman D W(N端含有疏水性氨基酸)等的观点，还有学者发现肽链中催化部位Zn(Ⅱ)和肽键的羰基氧之间的距离也影响其抑制活性［20］。目前，国内外对抗氧化机理较明确的肽是肌肽和谷胱甘肽，其余的抗氧化肽结构还没有确切的定论，总结前人的研究可知，抗氧化肽由二至十几个氨基酸残基组成，通过含有的酸性氨基酸或组氨酸的侧链螯合金属离子减缓氧化作用，或者因为疏水性氨基酸的组合结构容易结合氧加之以有质子供体提供氢原子阻止自由基链式反应，如Tyr和Trp。另外，还会受到抗氧化氨基酸以及氨基酸间短程相互作用的空间构象影响。对比以上两者，对抗菌肽有进一步的二级结构研究，其分子量也相对较大，抗菌肽C端多含有疏水性氨基酸如Ala、Leu或Trp，N端富含碱性氨基酸如Lys、Arg，从而形成两亲分子，N端的正电荷会和菌膜的负电荷结合，C端进入膜脂质双分子层。多数抗菌肽的第二位氨基酸残基为色氨酸或中间富含脯氨酸也会直接影响其抗菌活性;目前发现的抗菌肽种类中二级结构共有四种构型，β折叠只是稳定构象，C端环状结构比片层结构对活性的影响较大，而α螺旋对抗菌肽的活性起到至关重要的作用［21］。

4 贝类活性肽开发过程中存在的问题

较国外的研究状况，国内对于贝类活性肽的研究与开发还比较薄弱，虽然近年来对贝类多肽的提取方法和活性的研究也取得了一定的进展，但要更进一步解析其结构与活性的关系以及实现高纯度活性肽的生产，还存在以下问题有待解决。

4.1 分离纯化技术限制

热点研究的贝类活性肽分子主要集中在3000u以下，鉴于市场那对目的活性肽的纯度和活性要求，现有的纯化手段还无法实现单一活性肽的分离富集。另外，含有目的肽的酶解液中存在的盐分，在一定程度上也会影响肽的活性测定。针对在1000u以下的目的肽段来说，脱盐一直是一个棘手的问题，这也是目前大多数贝类活性肽的研究只能集中在500u以上肽段的原因［22］。

4.2 定向酶解不稳定

根据现有的生物技术和生物工程条件还无法实现对目的活性肽分子的精确酶切;另一方面，得到的目的肽分子的活性容易受到外界条件的影响，保存还需要进一步磷酸化、酰化和糖基化来稳定肽段。

4.3 产生苦味

天然活性多肽苦味的产生是由于酶解过程中产生了一些具有苦味的疏水性氨基酸或其衍生物。目前多采用化学修饰掩盖苦味和使用端肽酶及吸附树脂去苦味［23］，但仍无法完全解决苦味的问题。

5 贝类活性多肽的应用前景

5.1 在医药行业的应用

自古以来，医书上就有记载贝类的特殊疗效，所以开发贝类功能活性肽在医药行业中的应用具有广阔的前景。目前开发较成功的当属牡蛎产品，如“东海三豪”、“牡蛎EXT全营养片”以及“海王金樽”，而其他贝类的药用研究主要集中在文蛤多肽的抗癌和抗肿瘤活性方面，例如上海市第二人民医院已对文蛤中的不同蛋白质成分做了小鼠验证试验和临床验证，结果表明其提取物在帮助肿瘤患者延长存活时间方面起到一定的作用［24］。国内成功投产的贝类肽药物有以海洋贝类牛磺酸为主要成分的力多精和鱼蛋白等。抗氧化肽和ACE抑制肽具有延缓衰老，防止血管疾病的效用，此类保健品包括具有免疫调节兼具辅助降血糖功能的“银蜊胶囊”和具有抗氧化功能的“银蜊蛋白酶解肽粉”。

5.2 在食品行业的应用

贝类活性肽营养丰富，且可以改善肠道和调节机体生理活动，所以作为功能食品开发有很好的前景。目前酶解贝类蛋白获得氨基酸种类齐全的功能活性短肽产品，在市面上常见的是扇贝裙边制品:海之味扇贝裙边食品、扇贝调味汁，贝类调味品。蔡冰娜等［25］用动物实验证明了牡蛎肽肠内营养制剂对肠道功能的修复作用，理论证明了它对临床病人肠道障碍发挥缓解作用的可行性。在食品保鲜贮藏及加工方面另一具有应用价值的是贝类抗菌肽产品，抗菌肽具有较好的广谱抗菌性，可作为食品天然防腐保鲜剂。宋宏霞等［26］用贻贝粗抗菌肽对鲈鱼进行保鲜研究，结果证明了贻贝粗抗菌肽的抗菌效果与山梨酸钾以及壳聚糖相当，具有广阔开发前景。

5.3 在化妆品行业的应用

天然抗氧化肽也是化妆品行业之新宠，大部分海洋活性多肽可以作为细胞生长因子，影响多种类型细胞的生长，对美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合都有极其明显的效果。孙恢礼等［27-28］人与保健品公司合作，研制了一种含有海洋贝类活性肽的化妆品并公布其制备方法，另外还申请了一项应用海洋贝类活性肽和海洋胶原蛋白肽细致毛孔的化妆品专利。

海洋生物因其生存环境的特殊性，使得海洋蛋白质与陆地生物蛋白存在很大的差异，酶解释放的活性多肽具有一定的优越性。我国海洋贝类资源丰富，若能加强对海洋酶类的制取研究，就能提高贝类蛋白的酶解率和活性功能肽的制备能力，并实现海洋贝类的高值化利用，从而扩大用于各个工业领域中，以增强我国贝类活性肽开发利用的国际竞争力。

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