富硒酸奶发酵条件优化及贮藏期间理化性质研究

张 蓉， 刘 冬， 张 敏， 叶 明

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

硒具有提高机体免疫力、清除自由基、延缓衰老、预防肿瘤和心血管疾病等多种功能［1］。缺硒会引起克山病、大骨节病等，在我国约有300多个地区出现缺硒病［2］。天然食物中硒含量普遍较低，通过人工富集方法将无机硒转化为有机硒，不但可以提高硒的生理活性和吸收率，同时可降低无机硒的毒副作用［3］。

酸奶具有平衡肠道菌群、防止乳糖不耐症、降低胆固醇吸收、预防心血管疾病、提高机体免疫力及促进钙的吸收等作用。在酸奶中添加植源性功能原料（茶、山核桃等）、微量元素（铬、锌）等功能因子［4－7］，可提高酸奶营养价值和强化酸奶的保健功能。文献［8］利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同富硒生产富硒保健酸奶。但利用青春双歧杆菌和干酪乳杆菌制备富硒酸奶的相关报道并不多。双歧杆菌是机体肠道中的优势菌，具有调节肠道菌群平衡、改善人体代谢等多种生理作用［9］。干酪乳杆菌耐受有机体口腔酶类、胃酸和胆汁酸等，进入人体后可在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体的消化吸收等作用［10］。

本课题组对青春双歧杆菌和干酪乳杆菌富硒条件进行研究，得到具有良好发酵性能的富硒发酵剂［11］，在此基础上，本文利用富硒青春双歧杆菌和干酪乳杆菌通过中心组合试验（CCD）对富硒酸奶的发酵条件进行优化，并对其贮藏期间理化性质变化进行研究，将酸奶与有机硒相结合，更好地发挥两者的保健功能。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

菌株为青春双歧杆菌、干酪乳杆菌，由合肥工业大学微生物资源与应用研究室从市售酸奶中分离保藏，经富硒后得富硒青春双歧杆菌和干酪乳杆菌［11］；雀巢全脂奶粉，购于合肥家乐福超市；酪蛋白酸钠、低聚异麦芽糖、亚硒酸钠等均为食品级，购于郑州浩力食品添加剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

752紫外－可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；Forma 1029厌氧培养系统，美国Thermo公司；MWCO 3500透析袋，合肥博美科贸有限公司；SKD－600自动凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂的制备

将富硒菌种青春双歧杆菌和干酪乳杆菌混合富硒培养物［11］置于50mL无菌离心管中，在4℃、10 000r／min条件下冷冻离心10min，用一定体积的10%脱脂复原乳（108℃灭菌20min）将菌体洗下并调整至约4×108cfu／mL，即得液态富硒酸奶发酵剂。将液态富硒酸奶发酵剂置于低温冰箱（－20℃）预冷2h，取出置于真空冷冻干燥机中干燥48h，冷冻温度－50℃，真空度为20Pa，即得固态富硒酸奶发酵剂。

将上述固态富硒酸奶发酵剂按2g／L的接种量接于10%脱脂乳培养基中37℃发酵培养12h，于4℃冰箱中冷藏，即得富硒发酵剂。

1.3.2 富硒酸奶感官评价

由10名具有食品专业背景的人员组成感官评定小组，参考凝固型酸牛奶感官评分表［12］，从滋味、气味、组织状态、色泽进行评价，汇总评分。

1.3.3 富硒酸奶主要指标的测定

富硒酸奶主要指标参考文献［13］测定，脱水收缩值和乳酸菌数分别参考文献［14］和文献［15］进行测定，实验重复3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。

1.3.4 有机硒质量比测定

取10g酸乳加入截留分子质量为3 500Da透析袋中，并置于去离子水中透析至无硒析出时，将酸 奶 在4 ℃、10 000r／min条件 下，离心10min，弃上清液用去离子水洗涤3次，60℃干燥至恒重。参考文献［16］的方法，以3，3－氨基联苯胺比色法［17］测定硒的质量比。实验重复3次，其结果以“平均值±标准偏差”表示。

1.3.5 单因素试验

亚硒酸钠添加量选择40～80μg／kg；接种量选择体积分数为1.5%～7.5%；发酵温度选择36～44℃；发酵时间选择5～9h，考察各因素对酸奶感官品质和酸度等指标的影响。

低聚糖和稳定剂的质量分数：低聚糖（低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚果糖、大豆低聚糖）按照1%或2%添加，稳定剂（酪蛋白酸钠、海藻酸钠、果胶）按照0.5%～2.0%添加到12%复原乳中。于42℃下培养6h，考察低聚糖对富硒酸奶感官品质等的影响。

1.3.6 中心组合试验

依据单因素试验选择亚硒酸钠添加量、接种量及酪蛋白酸钠进行中心组合试验，并做验证实验。用Design Expert 7.0软件对中心组合试验结果进行处理，采用F检验对数据进行方差分析。

2 结果和分析

2.1 亚硒酸钠添加量和接种量的确定

不同亚硒酸钠添加量和接种量下酸奶感官总分和酸度如图1所示，由图1a可知，当亚硒酸钠添加量为40～80μg／kg时，富硒酸奶的感官总分变化不大，该范围内富硒酸奶的感官总分先轻微上升，之后迅速下降，分析原因是当亚硒酸钠添加量大于70μg／kg时，酸奶颜色微黄，口感发涩，而造成感官总分急剧下降；富硒酸奶可滴定酸度变化不大，均在77oT左右。为提高富硒酸奶中硒的质量比，选择亚硒酸钠添加量为60μg／kg，该加硒量符合关于强化硒的相关规定［18］，此时富硒酸奶呈乳白色，奶香纯正，口感细腻。

由图1b可看出，接种量为1.5%～4.5%时，富硒酸奶的感官总分随接种量的增加而增加，而在4.5%～7.5%范围内感官总分随接种量的增加呈下降趋势。接种量在1.5%～7.5%范围内，酸度随接种量的增加而增加。为保证富硒酸奶酸甜适当，故选择适宜的接种量为4.5%。

图1 不同亚硒酸钠添加量和接种量下酸奶感官总分和酸度

2.2 发酵温度和时间的确定

不同发酵时间和温度下酸奶感官总分和酸度如图2所示。

由图2a可看出，发酵时间为5～7h时，感官总分呈增加趋势，而后呈下降趋势。富硒酸奶的酸度随发酵时间的增加而增加，即发酵时间为7h感官总分最大为8.0，此时富硒酸奶的酸度为76.7oT。由图2b可看出，发酵温度为36～40℃时，富硒酸奶的感官总分随发酵温度的增加而增加，在40℃时富硒酸奶的感官总分最高为9.0。发酵温度高于40℃时，感官总分随发酵温度的增加而快速下降。发酵温度为36～42℃，富硒酸奶的酸度呈增加趋势，而高于42℃时酸度缓慢下降，可能是过高的温度（44℃）抑制了富硒酸奶发酵剂的活力。

图2 不同发酵时间和温度下酸奶感官总分和酸度

2.3 低聚糖种类及其添加量的确定

不同低聚糖及其添加量下的感官总分如图3所示。从图3可看出，在添加5%蔗糖的基础上，分别添加1%或2%的低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖和大豆低聚糖，以1%的低聚异麦芽糖和5%蔗糖混合添加到复原乳中，发酵制备的富硒酸奶酸甜适中，感官总分最高为8.7。

图3 不同低聚糖及其添加量下的感官总分

2.4 稳定剂种类及其添加量的确定

稳定剂对酸奶感官总分和脱水收缩值的影响如图4所示，由图4可看出，当果胶的添加量大于0.5%时，随其添加量的增加富硒酸奶的感官总分呈下降趋，而脱水收缩值呈上升趋势。相比于0.5%的果胶，添加1%的海藻酸钠的富硒感官总分较低，且每100g脱水收缩量为20.6g。而添加1%的酪蛋白酸纳，富硒酸奶凝乳完全、无乳清析出、呈乳白色、口感黏稠细腻，感官总分最高约8.5。此外，酪蛋白酸钠的添加还可以提高富硒酸奶中蛋白质质量分数，所以选择1%的酪蛋白酸钠作为稳定剂。

图4 稳定剂对酸奶感官总分和脱水收缩值的影响

2.5 中心组合试验

依据单因素试验选择亚硒酸钠、接种量及酪蛋白酸钠进行中心组合试验，因素水平见表1所列。利用Design Expert 7.0对试验数据进行分析，其结果及感官评分结果见表2所列。

二次多项式模型回归系数估计和试验结果方差分析结果见表3所列，对菌体含硒量的影响程度从大到小依次为B＞A＞C，即接种量＞亚硒酸钠＞酪蛋白酸钠，回归方程为：

表1 响应面试验的因素水平表

表２ 中心组合试验设计与结果

根据回归方程可得3因素交互作用响应面，如图5所示。由图5可知，随着接种量的增加，富硒酸奶的感官总分呈先增加后减少的趋势。类似地随亚硒酸钠和酪蛋白酸钠添加量的增加，富硒酸奶的感官总分也呈同样的趋势。回归方程存在最大值点，利用方程计算得感官总分最大为8.88，此时接种量为4.54%，亚硒酸钠添加量为61.76μg／kg，酪蛋白酸钠添加量为1.4%。

表3 二次多项式模型回归系数估计和试验结果方差分析结果

图5 3因素交互作用响应面

2.6 验证试验

在上述最优条件下进行验证试验，富硒酸奶凝乳完全，呈乳白色，有光泽，具有酸奶固有滋味和香味，酸甜协调，组织均匀细腻，无乳清析出，无气泡和裂纹，感官总分为9.1，略高于回归方程所得的预测值（感官总分约为8.9）。此外，富硒酸奶中有机硒质量比为29.2μg／kg。

2.7 富硒酸奶贮藏期间理化指标变化

25d贮藏期内，富硒酸奶中的蛋白质和脂肪含量呈下降趋势，仍符合文献［13］相关规定。脱水收缩值在1～25d内呈增加趋势，与文献［19］结果一致。非脂乳固体在第25天时的质量分数为6.2%，较第1天减少了0.9%。pH值呈缓慢下降趋势，可能是乳酸菌继续代谢产酸所致。乳酸菌数也随储藏时间的延长而下降，但在第25天时乳酸菌总数为2.88×107cfu／mL，仍符合GB 19302关于乳酸菌的规定（≥1×106cfu／mL）。此外，富硒酸奶中有机硒的质量比在第1天和第25天分别为30.1μg／kg和29.8μg／kg，可见有机硒的质量比相对稳定。具体结果见表4所列。

表4 贮藏期间富硒酸奶理化性质和乳酸菌数的变化

3 讨 论

本文选用经过富集硒的青春双歧杆菌和干酪乳杆菌进行混合发酵制备酸奶，并添加1%低聚异麦芽糖作为益生因子，通过CCD试验获得其最佳发酵条件如下：奶粉添加量为12%、蔗糖添加量为5%、低聚异麦芽糖添加量为1%、亚硒酸钠添加量为 61.8μg／kg、酪蛋白酸钠添加量为1.4%，接种量为4.5%、发酵温度为40℃、发酵时间为7h，由此制备得一种新型富硒酸奶。该富硒酸奶感官总分为9.1，有机硒质量比为29.2μg／kg。在25d、4℃贮藏期间内富硒酸奶的蛋白质、脂肪、脱水收缩值、非脂乳固体和pH值等理化指标均符合文献［13］的相关规定，且在第25天活菌数仍达到2.88×107cfu／mL，高于关于乳酸菌数的规定（≥1×106cfu／mL），由此可以延长富硒酸奶的货架期。与普通酸奶相比，富硒酸奶除具有酸奶的保健功能外，其中富含的有机硒还可以补充人体所需的硒元素，减少缺硒病的发生，且其中富含的青春双歧杆菌和干酪乳杆菌比一般乳酸菌更易在肠道定植，增加肠道有益菌，调节肠道菌群平衡，维持机体健康［9－10］。

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