小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

刘 璐， 刘 健

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

肥大细胞在人体内参与伤口愈合、血管发生、天然免疫和获得性免疫，目前研究表明，肥大细胞在多发性硬化、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、主动脉瘤、癌症以及饮食导致的肥胖和糖尿病等疾病中起重要作用［1］。成熟的肥大细胞通过脱颗粒分泌大量生物活性物质，包括生物胺类（如组胺和血清素）、细胞因子（如肿瘤坏死因子等）、丝甘蛋白聚糖、多种溶酶体酶和一系列特异的肥大细胞蛋白酶（mast cell protease，简称MCP，如类糜蛋白酶、类胰蛋白酶、羧肽酶A）。当肥大细胞被诱导脱颗粒，这些介质就会随之释放，其中MCP占肥大细胞分泌蛋白总量25%以上。

在这些MCP中，类糜蛋白酶能诱导嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞聚集［2］，从而引起微血管通透性增强［3］，通过选择性酶解基质蛋白，激活蛋白酶受体，激活基质金属蛋白酶促进组织重建［4］，在过敏性疾病（如哮喘、特应性皮炎等）炎症发生发展中起促进作用［5－6］，并与心血管疾病的发生发展密切相关［7］。在小鼠体内，肥大细胞表达多种类糜蛋白酶（mMCP－1，mMCP－2，mMCP－4，mMCP－5，mMCP－9），mMCP－4的底物特异性高度相似于人的类糜蛋白酶，并且在小鼠体内组织的分布和人体类糜蛋白酶相似，所以小鼠mMCP－4可认为是最接近人体类糜蛋白酶的同系物，可以用mMCP－4在小鼠体内的作用推断人体类糜蛋白酶的相关作用［8］。

为进一步研究mMCP－4的生物学活性及其与各种疾病的关系，本文将mMCP－4克隆到原核表达载体pET28a，利用大肠杆菌系统表达获得重组蛋白mMCP－4。使用纯化后的重组蛋白免疫兔子，制备mMCP－4多克隆抗体，并对获得的多克隆抗体的效价和专一性进行鉴定和分析。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

刀豆素、PEG8000、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自SIGMA公司；蛋白定量试剂盒、氯仿、异丙醇、乙醇购自国药公司；RNAiso Plus、RT－PCR试剂盒、BamH I和Xho I限制性内切酶、Solution I连接酶购自TAKARA公司；反转录试剂盒购自Invitrogen公司；IPTG购自上海生工公司；羊抗兔IgG－HRP购自 KPI公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit购自AXYGEN公司；RPMI MediuM1640购自Gibco公司；Ni SepharoseTMHigh Performance购自GE公司；HRP－DAB显色试剂盒、Super Singnal West Pico化学发光底物购自Thermo公司；感受态JM109、大肠杆菌BL21（DE3）、质粒pET28a由本实验室保藏。

C57BL／6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，新西兰大白兔购自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 脾细胞及小鼠cDNA的制备

取健康8周大C57BL／6小鼠的脾细胞，用RPMI1640培养基（含有10%FBS，1%双抗，25mg／L刀豆素）37℃培养24h。根据总RNA提取试剂盒提取刀豆素刺激后的脾细胞总RNA，以Oligo d（T）18Primers为引物，M－MLV为逆转录酶，合成小鼠cDNA，置于－20℃备用。

1.2.2 引物的设计与合成

根据GenBank发表的小鼠 MCP－4mRNA序列（登录号为NM－010779）设计嵌套引物，预期扩增长度为709bp。

正义引物为：

反义引物为：

分别在引物P2、P3两端加入BamH I和Xho I的酶切位点。

1.2.3 PCR扩增 mMCP－4

获得的cDNA 0.2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，引物P1（10μmol／L）和P3（10μmol／L）各1μL，2.5mmol／L dNTP 2.5μL，Taq DNA Polymerase 0.2μL，加DW 补至25μL，混匀。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min，得到一次PCR产物。

一次PCR产物1μL，10×PCR Buffer 5μL，引物P2（10μmol／L）和P3（10μmol／L）各2μL，2.5mmol／L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.4μL，加DW补至50μL，混匀。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min，得到二次PCR产物。

1.2.4 构建原核表达载体pET28a－mMCP－4

凝胶回收试剂盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit）回收二次PCR产物并计算其质量浓度。用BamH I和XhoI限制性内切酶对胶回收产物和质粒pET28a进行酶切，37℃放置3～4h。胶回收酶切好的PCR产物和质粒pET28a，16℃连接过夜。用连接产物转化感受态细胞JM109，把染化后的菌液涂在含有卡拉霉素（Ka－na）抗性的培养板上，37℃过夜。RT－PCR和双酶切鉴定获得重组质粒pET28a－mMCP－4，送Invitrogen公司进行测序获得阳性克隆［9］。

1.2.5 mMCP－4融合蛋白的表达及纯化

重组质粒pET28a－mMCP－4转化大肠杆菌BL21，挑阳性菌落接入到3mL含有Kana（30μg／mL）的LB培养基中，200r／min，37℃培养过夜。第2天，将菌液按1∶100的比例接入3mL含有Kana（30μg／mL）的LB培养基，进行小规模诱导，37℃培养至对数生长期，按1∶1 000向其中加入0.8mol／L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导4～6h。分别取相当于0.2OD550的菌液，离心后重悬于SDS－PAGE上样缓冲液中，100℃煮沸变性10min，进行SDSPAGE电泳检测mMCP－4是否表达。小规模诱导检测重组质粒pET28a－mMCP－4在BL21中成功表达后，大规模诱导，菌液4℃12 000g离心后重悬于pH值为7.4的Tris－HCl，超声破碎菌液，工作5s，间歇15s，重复40次，4℃12 000g离心20min，弃上清。将沉淀用Tris－HCl洗3次，沉淀 重 悬 于 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，0.3mol／LNaCl，6mol／L尿素，5mmol／L咪唑，pH值为7.4）中，4℃保存过夜。裂解液4℃12 000g离心30min，取上清液用过滤器过滤后，用Ni亲和层析柱纯化蛋白，SDS－PAGE检测。

1.2.6 兔抗mMCP－4抗体的制备及效价测定

纯化好的重组蛋白（约1mg）与弗氏完全佐剂按照1∶1的体积比混匀，进行皮下多点注射。14d后以等量蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫，后每2周加强1次。第4次加强免疫10d后，在兔子耳缘静脉取血0.5～1mL，分离抗血清［10］。用纯化的 mMCP－4重组蛋白包被ELISA反应板，利用ELISA法测定抗体效价，其中一抗为倍比稀释的免疫后兔血清，阴性对照为免疫前兔血清。效价达到1∶100 000以上时，经颈动脉放血，收集血清，分装后－80℃保存备用。

1.2.7 western blot检测抗体特异性

提取小鼠腹膜肥大细胞总蛋白，经SDSPAGE电泳分离后，电转移至PVDF膜，4℃封闭过夜，一抗为制备的兔抗血清（1∶5 000），37℃反应1h，PBST洗5次，每次5min，二抗为辣根过氧化物酶标记（HRP）的羊抗兔抗体（1∶3 000），37℃反应1h，PBST洗5次，每次5min。加化学发光底物反应后拍照［11］。

2 结果与讨论

2.1 pET28a－mMCP－4的构建

以小鼠脾细胞cDNA为模板，通过RT－PCR扩增目的基因 mMCP－4（709bp），将其重组入表达载体pET28a后，转化感受态JM109。重组质粒RT－PCR和BamH I、Xho I双酶切鉴定结果如图1所示。

图1中，M为DNA标记；1代表BamH I、XhoI双酶切重组质粒；2代表重组质粒经RTPCR鉴定的目的条带。

从图1可看出，第1泳道和第2泳道均出现约700bp的预期片段，说明获得重组质粒。将酶切鉴定正确的质粒送去测序，序列正确的重组质粒命名为pET8a－mMCP－4。

图1 重组质粒的双酶切和RT－PCR鉴定

2.2 融合蛋白的表达与纯化

构建的重组表达载体成功转化为大肠杆菌BL21后，挑取单菌落摇菌，菌液按1∶100接种于LB培养基，37℃培养至对数期时加IPTG诱导，收集未诱导和分别诱导2、4、6h后的菌液样品，SDS－PAGE电泳检测如图2所示。

图2a中，M为蛋白标记；1代表未诱导；2～4分别代表加IPTG诱导2、4、6h；图2b中，M为蛋白标记；1代表纯化的mMCP－4重组蛋白；2代表破碎后沉淀；3代表表达细菌总蛋白。

从图2可以看出，检测泳道与对照泳道相比，泳道2、3、4都出现与预期28.7kDa大致相符的特异性条带，且在4h时表达量最大。表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在于超声破碎后的沉淀中，将包涵体溶于裂解液中，通过Ni亲和层析柱分离，最终获得用于抗体制备的重组蛋白mMCP－4。

图2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达情况及其纯化

2.3 ELISA法检测抗血清效价

每孔用2pmol／L的mMCP－4重组蛋白作为抗原包被酶标板，2%脱脂奶粉封闭，将抗血清按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000稀释后加入酶标板孵育。洗涤后加入HRP标记的羊抗兔为二抗，最后以四甲基联苯胺（TMB）为底物，显色后测定450nm波长的吸光度。以免疫前血清为对照，每个稀释度重复3次，免疫后血清吸光度与免疫前血清吸光度的比值大于2.1，且免疫后血清吸光度大于0.4为阳性。mMCP－4抗体ELISA效价如图3所示。图3表明，制备的抗血清效价达1∶128 000。

图3 mMCP－4抗体ELISA效价

2.4 western blot检测

为检测制备的抗血清特异性，提取小鼠腹膜肥大细胞蛋白进行western blot检测，其检测结果如图4所示，图4中，1、2为小鼠腹膜肥大细胞；3、4为小鼠肝癌细胞H22。以小鼠肝癌细胞H22作为阴性对照，制备的兔抗血清为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗。由图4可知，抗血清能识别小鼠腹膜肥大细胞中的蛋白，而在肝癌细胞H22中无明显反应，说明所制备的抗体具有较好的特异性。

图4 western blot检测抗血清特异性

3 讨 论

目前，外源蛋白的表达系统有很多，其中大肠杆菌表达系统具有培养方便、操作简单、成本低廉、表达量大、易于纯化及易于工业化批量生产等优点。实验中刀豆素诱导鼠脾细胞能表达较高水平的mMCP－4，通过RT－PCR扩增出目的基因，通过BamH I和Xho I切点整合入pET28a质粒，成功构建重组表达载体pET28a－mMCP－4，然后转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导BL21表达融合蛋白，超声破碎后，通过SDS－PAGE鉴定在28.7kDa处有明显的特异蛋白条带，利用Ni亲和层析柱纯化含有his－tag的mMCP－4蛋白。

制备抗体需要获得高纯度的目的蛋白，本研究以纯化的重组蛋白mMCP－4作为抗原，既可提高抗原的纯度，也使其制备抗体时有较高的免疫原性，且选用了免疫周期长、少量多次免疫兔子，更有利于制备高特异性、高效价的mMCP－4多克隆抗体。获得的兔抗血清，ELISA测其效价达1∶128 000。提取小鼠腹膜肥大细胞总蛋白进行western blot检测mMCP－4多克隆抗体的专一性，结果只出现一条特异性条带，说明制备的多克隆抗体具有较好的特异性。

人肥大细胞分泌的类糜蛋白在多种疾病中起重要作用，研究表明，它是变态反应性疾病和心血管疾病一个新的治疗靶点。在小鼠体内通过缺失MCP－4产生 MCP－4－／－小鼠，证明 mMCP－4在过敏性器官反应中能中和肥大细胞的有害作用［12］，并且mMCP－4缺失后小鼠腹主动脉瘤形成受到抑制［13］。本实验mMCP－4重组蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备，为建立较方便的免疫学检测方法及探求mMCP－4在鼠体内的生物学功能奠定了基础。

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