高效液相色谱法同时测定饲料中多种酚类抗氧化剂和尼泊金酯类防腐剂

乐山市产品质量监督检验所 杨春林 李佳峻 胡 强 吴 蔚 吕小艇

脂类氧化酸败是饲料在加工、储运和使用过程中发生品质恶化的主要原因之一 （黄涛等，2004）。在饲料中添加抗氧化剂能够阻止或延缓饲料中某些营养物质氧化，延长饲料贮存时间（张曼等，2006）。可作为抗氧化剂的物质很多，其中没食子酸丙酯（PG）、叔丁基羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）等酚类抗氧化剂目前应用最为广泛（杨晓凤，2011）。除此之外，防腐剂也是常用的保证饲料安全卫生的手段。尼泊金酯（又名对羟基苯甲酸酯）作为常用防腐剂之一，其抑菌范围广、毒性低、防腐效率高且防腐效果受pH变化的影响小，是饲料中常用的防腐剂（周建科等，2010）。由于人工合成的防腐剂和抗氧化剂对机体具有不同程度的毒副作用，在饲料中过量使用，会在动物体内造成残留（郑萍和陈西平，2008）。目前，酚类抗氧化剂和尼泊金酯类防腐剂的检测方法主要有高效液相色谱法（曹淑瑞等，2012；胡小钟等，2000）、气相色谱法 （李兴根和韩世玲，2006）、气相色谱-质谱法（郭岚等，2007）、液相色谱-串联质谱法（汪隽等，2008；林安清等，2007）、薄层色谱法（朱玉和李永红，1998）及胶束电动毛细管电泳法 （曹小妹等，2012；高勇等，2010；Blanco 等，2009）。这些方法大多只针对其中一类物质的检测，同时检测上述两类物质的方法少有报道。本实验通过对样品前处理方法、检测通道、流动相组成及梯度洗脱程序等色谱条件进行优化，建立了同时测定饲料中4种酚类抗氧化剂和3种尼泊金酯类防腐剂的高效液相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪LC-20A（配自动进样系统、二极管阵列检测器），日本Shi-madzu公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；氮吹仪N-EVAP，美国Organomation公司；电子天平DV215CD（精确至0.00001 g），美国O-haus公司；超声波清洗器，上海冠特超声仪器有限公司。

甲醇、乙腈（色谱纯），美国Tedia公司；标准品：尼泊金甲酯（MHB）、尼泊金乙酯（EHB）、尼泊金丙酯（IPHB）、没食子酸丙酯（PG）、丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）及特丁基对苯二酚（THBQ），均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。1.2 色谱分析条件 色谱柱：Inertsil ODS-sp C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm）； 流动相：A 为甲醇，B为酸性乙酸铵溶液（pH值为3.5），使用前过0.22 μm 滤膜； 梯度洗脱程序：0～3 min，B为45%；3～8 min，B从45%线性降至 0，保持7 min；15～20 min，B从0线性升至45%，保持7 min。柱温：40 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量 20 μL；采用双通道法分别在波长280 nm和256 nm对两类物质进行检测。

1.3 标准曲线

1.3.1 标准储备液配制 准确称取尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯及特丁基对苯二酚标准品各10 mg（精确至0.01 mg），用色谱纯的甲醇溶解并定容成浓度为200 mg/L的标准储备液。

1.3.2 标准曲线的建立 取标准储备液适量用甲醇-乙腈溶液 （30∶70，V∶V）稀释定容成浓度为0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL的工作溶液，取20 μL进样测定峰面积，以质量浓度对峰面积作曲线。

1.4 样品处理 准确称取粉碎后过80目筛的饲料样品1 g（精确至0.0001 g）于50 mL比色管中，加入3 mL色谱纯甲醇充分润湿后于漩涡振荡器上振荡2 min，再加入7 mL乙腈，40℃条件下超声提取15 min，8000 r/min离心5 min，取上层有机相；重复提取3次，合并有机相，定性滤纸过滤后用0.2 μm针孔过滤器滤于鸡心瓶中；45℃条件下用氮吹仪吹至近干，甲醇-乙腈溶液（30∶70，V∶V）溶解残渣并定容至5 mL，待测。

1.5 回收率与精密度 取粉碎过筛后的均匀饲料样品3份，加入7种标准品的混合溶液，使其含量分别为10、30、50 mg/kg，按1.4中的方法进行样品前处理。每个处理重复6次，按1.2中的色谱条件对加标样品提取液中的7种目标化合物定量，考察方法的回收率和精密度。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱及洗脱条件选择 色谱柱的填料组分、粒径大小、规格型号等因素对目标化合物的保留效果尤其是多组分的有效分离具有重要的影响，所以选择适合的色谱柱是实现多组分化合物的分离和定量的关键步骤。本实验分别比较了4种色谱柱对7种目标化合物的分离效果，色谱柱Ⅰ：ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm × 100 mm，3.5 μm）； 色谱柱Ⅱ：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色谱柱Ⅲ：ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色谱柱Ⅳ：Inertsil ODS-sp C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。在实验的过程中同时优化确立了甲醇-乙酸铵溶液（用甲酸调节pH至3.5）作为流动相的梯度洗脱程序。结果表明，在优化的流动相条件下，色谱柱Ⅰ的峰形较差且有3种目标物质不能得到基线分离，色谱柱Ⅱ和Ⅲ所得的峰形较色谱柱Ⅰ有一定的改善，但是没食子酸丙酯与尼泊金甲酯无法完全分离，影响该两种物质的准确定量，色谱柱Ⅳ能使7种物质全部实现基线分离，峰形尖锐对称。实验最后以色谱柱Ⅳ作为色谱柱，采用确立的流动相及梯度洗脱程序对7种物质进行高效液相色谱分离，取得不错的效果。

2.2 检测波长的选择 用二极管阵列检测器对7种目标物质进行全波长扫描，结果表明，4种酚类抗氧化剂（PG、BHA、BHT、TBHQ）的最大吸收波长均在280 nm附近，而3种尼泊金酯的最大吸收波长在256 nm附近。选择256 nm作为检测波长时，3种尼泊金酯的灵敏度较高，但是4种抗氧化剂的响应值非常低（图1A），导致方法检出限偏高；而采用280 nm作为检测波长，则会大大降低3种尼泊金酯的灵敏度（图1B）。为了使各种目标物质的灵敏度达到最高，我们采用了双通道法进行检测，在256 nm波长条件下对尼泊金酯定量，280 nm条件下对酚类抗氧化剂定量，7种物质的双通道重叠色谱图见图1C。

图1 标准混合溶液色谱图

2.3 样品提取条件 样品的提取条件主要包括提取溶剂的组成与比例、提取的方式、提取时间等因素。其中，提取溶剂的组成与比例不但直接影响样品中目标组分的提取效率并且对提取液中杂质含量的多少具有决定性作用，选择适合的提取溶剂对消除杂质干扰和提高回收率具有非常积极的意义。通过涡旋振荡与超声波提取相结合的方法，比较几种常见的提取溶剂对回收率的影响，结果表明，甲醇对饲料中7种目标物质的提取效果均比较理想。但是，研究也发现，饲料中含有的部分脂肪和蛋白质会被甲醇提取出来，会带来干扰并污染色谱系统。最终采用甲醇-乙腈体系（30∶70，V∶V）作为提取溶剂，利用乙腈对脂肪的弱溶解性及其对蛋白质的沉淀作用来消除部分杂质干扰。应用建立的样品处理方法和优化的色谱条件对实际样品进行测定，结果表明，该方法得到的样品提取液非常干净，对样品定量的干扰较小，空白样品及加标样品典型色谱图见图2。

2.4 线性范围、检出限和定量限 取适量标准储备液用甲醇-乙腈溶液稀释定容成浓度为0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL 的工作溶液，取20 μL按仪器工作条件测定。以质量浓度对峰面积作校正曲线，得到线性回归方程，7种物质浓度为0.1～100.0 μg/mL时线性关系良好，相关系数均大于0.9999，线性参数见表1。以3倍信噪比为检出限（LOD），计算得出6种物质的检出限分别为0.027～0.102 mg/L。以10倍信噪比计算得出定量限 （LOQ）为0.090～0.332 mg/L。

图2 某品牌鱼饲料空白样品及加标样品色谱图

表1 线性参数、检测限（LOD）和定量限（LOQ）

2.5 方法的回收率和精密度 采用在空白饲料样品中添加混合标准溶液的方法，对7种物质进行3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度6次重复，按建立的试验方法进行处理和分析，考察方法的精密度，结果见表2和表3。7种限量物质添加浓度为10.0～50.0 mg/kg，平均回收率为79.62%～112.29%，相对标准偏差为2.65%～8.38%。

3 结论

本实验建立了同时检测饲料中7种限量物质的高效液相色谱方法。实验以有机溶剂提取饲料中的酚类抗氧化剂和尼泊金酯类防腐剂，利用乙腈对脂肪的弱溶解性和对蛋白质的沉淀作用，有效消除杂质干扰，定性准确。采用双通道法分别在波长256 nm和280 nm同时检测，最大限度地保证每种目标化合物的检测灵敏度。本方法对色谱条件及样品提取方法进行了优化，具有速度快、灵敏度高、定量准确、操作简单等特点，可用于饲料中4种酚类抗氧化剂和3种尼泊金酯类防腐剂的同时测定。

表2 饲料中4种抗氧化剂的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

表3 饲料中3种尼泊金酯类防腐剂的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

[1]曹淑瑞，刘治勇，张雷，等.高效液相色谱法同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯[J].分析化学，2012，40（4）：529 ～ 533.

[2]曹小妹，王攀，张敬敬，等.毛细管胶束电动色谱法检测饲料中防腐剂[J].中国饲料，2012，7：34 ～ 36.

[3]高勇，何友昭，谢海洋，等.顶空液相微萃取-胶束电动毛细管色谱分析药品中酯类防腐剂[J].分析化学，2010，38（11）：1625 ～ 1628.

[4]郭岚，谢明勇，鄢爱平，等.气相色谱-质谱法同时测定食用植物油中三种抗氧化剂[J].分析科学学报，2007，23（2）：169 ～ 172.

[5]黄涛，陈喜斌，王全利，等.酚类饲料抗氧化剂及其构效关系研究[J].中国饲料，2004，9：26 ～ 40.

[6]胡小钟，余建新，钱浩明，等.油脂中九种抗氧化剂的反相高效液相色谱法分离和测定[J].分析科学学报，2000，16（1）：23 ～ 26.

[7]李兴根，韩芷玲.毛细管气相色谱法测定食品中的酚类抗氧化剂[J].粮油食品科技，2006，14（2）：55 ～ 56.

[8]林安清，张曼，唐丹舟，等.液相色谱-串联质谱法同时检测饲料中多种抗氧化剂[J].分析测试学报，2007，26（增刊）：278 ～ 280.

[9]汪隽，范必威，许淑霞.固相萃取-液质联用法测定乳制品中对羟基苯甲酸酯[J].食品科学，2008，29（7）：328 ～ 331.

[10]杨晓凤.凝胶渗透色谱净化-气相色谱法同时测定饲料中4种抗氧化剂[J].中国饲料，2011，5：38 ～ 44.

[11]张曼，何佳，林安清，等.高效液相色谱法同时测定饲料中8种抗氧化剂[J].口岸卫生控制，2006，11（5）：30 ～ 32.

[12]周建科，宋歌，刘瑞英，等.高效液相色谱法同时测定化妆品中尼泊金酯类防腐剂和特丁基对苯二酚 [J].河北大学学报 （自然科学版），2010，30（4）：385 ～ 388.

[13]郑萍，陈西平.几种防腐剂在化妆品中的作用效果评价[J].环境与健康杂志，2008，25（2）：114 ～ 116.

[14]朱玉，李永红.薄层色谱法测定对羟基苯甲酸酯合成产物中对羟基苯甲酸酯的产率[J].分析化学，1998，26（1）：120.

[15]Blanco E，Casais M，Mejuto M，et al.Combination of off-line solid-phase extraction and on-column sample stacking for sensitive determination of parabens and p-hydroxybenzoic acid in waters by non-aqueous capillary electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta，2009，647：104 ～ 111.