α-半乳糖苷酶水解底物的特异性及其在保育猪日粮中的应用

北京市营养源研究所 张 波 王继强 张宝彤＊

α-半乳糖苷是由一个蔗糖单位和1～4个α-半乳糖残基通过α-1，6-糖苷键连接构成的小分子低聚糖，分别生成棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖和筋骨草糖，通称为棉子糖。通常，大豆籽实、脱脂大豆（Kuo 等，1988）及豆粕（Grieshop 等，2003）中含有52.4～74.4 mg/kg的α-半乳糖苷。Kuriyama和Mendel（1917）首次研究报道了α-半乳糖苷的抗营养作用。单胃动物肠道黏膜缺乏降解棉子糖的酶，这些寡糖在大肠被寄居在大肠内的微生物发酵， 引起胃肠胀气 （Karr-Lilienthal等，2005）。α-半乳糖苷酶主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解 （Brouns等，2006）。不同来源的α-半乳糖苷酶其酶学性质不同，降解α-半乳糖苷的能力也不同。因此，研究其水解底物的特异性具有重要的意义。α-半乳糖苷酶在猪上的研究报道较少，并且日粮中添加α-半乳糖苷酶对动物生长性能影响研究结果不尽相同。因此，本试验研究了青霉来源α-半乳糖苷酶水解棉子糖类寡糖的特异性，并在此基础上验证在保育猪上的应用效果。

1 材料与方法

1.1 水解底物特异性试验

1.1.1 底物及试验用酶 蜜二糖、棉子糖和水苏糖均购于Sigma公司。α-半乳糖苷酶由重组青霉α-半乳糖苷酶菌株液态发酵所得，每毫升发酵上清液活性600 U。

酶活定义：在40℃、pH 5.2的条件下，每分钟从浓度为10 mmol/L的对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）溶液中降解释放1 μmol的对硝基酚所需要的酶量为1个酶活单位（U）。

1.1.2 水解反应及产物的测定 1 mL浓度为1.0 mg/mL的蜜二糖、棉子糖和水苏糖（柠檬酸-磷酸缓冲液，pH 5.2）分别与3 U的α-半乳糖苷酶液于37℃孵育16 h，同时3 U的酶液煮沸5 min灭活作为负对照。水解低聚糖释放的半乳糖通过离子色谱（DIONEX，ICS-3000）CARBOPAC PA10高效阴离子交换柱（4 mm×250 mm）和安培计进行检测。流动相是23 mmol/L NaOH，流速是1.0 mL/min。

1.2 动物试验

1.2.1 试验设计 72头平均体重（12.5±0.2）kg的杜×长×大公猪随机分到12个猪圈中，每圈6头。日粮参照《中华人民共和国农业行业标准——猪饲养标准》（2004）推荐的营养需要进行配制，日粮组成及营养水平见表1。试验期为3周。日粮不添加任何抗生素，以粉料饲喂。所有猪自由采食、饮水。试验共设两个处理，空白对照组饲喂基础日粮，加酶组在基础日粮基础上添加300 U/kg的α-Gal。所用的酶是液态发酵，发酵液于4℃离心，分离得到的上清液用稻糠壳吸附，自然风干，酶活为1200 U/g。

1.2.2 测定指标 在试验第21天，所有猪以圈为单位称重，记录采食量，计算日增重（ADG），料重比及日采食量（ADFI）。

1.2.3 统计分析 试验数据以圈为单位进行统计，采用SAS（8.0）单因子方差分析，以P＜0.05为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 α-半乳糖苷酶水解底物的特异性 由表2和图1可知，α-Gal对蜜二糖的降解效率最高，棉子糖以及水苏糖也可不同程度被降解。水解反应2 h时，蜜二糖水解释放出的D-半乳糖占总量的60%；水解反应4 h，蜜二糖、棉子糖和水苏糖水解释放的D-半乳糖量占总释放量的80%以上。由表2可见，在实验室条件下，蜜二糖、棉子糖和水苏糖水解率分别为95.7%、72.5%和32.9%。

表1 保育猪日粮组成及营养水平

表2 α-半乳糖苷酶的底物特异性

图1 寡糖水解曲线

2.2 α-半乳糖苷酶对保育猪生长性能的影响由表3可知，整个试验期猪生长良好。日粮中添加300 U/kg的α-半乳糖苷酶显著提高了保育猪平均日增重（ADG），与对照组相比，加酶组ADG提高9.76%（P=0.015）；加酶组料重比较对照组降低9.21%（P=0.020）；平均日采食量两组间无显著性差异。

3 讨论

棉子糖和水苏糖是豆粕中含α-半乳糖苷的主要抗营养因子，底物特异性试验结果表明，青霉来源的α-半乳糖苷酶对于天然的寡糖底物有特异性的水解作用，可以水解绝大多数蜜二糖及大部分的棉子糖，而水解水苏糖的能力最差，其趋势是随着寡糖链长度的增加水解能力逐渐减弱，这与Somiari和Balogh（1995）的报道相一致。而Manzanares等（1998）研究报道，Aniger产生的 α-半乳糖苷酶可以降解人工合成的底物 （pNPG）和天然的底物，如棉子糖、水苏糖和蜜二糖，且随着寡糖链长度的增加，水解释放半乳糖的能力增强。重组α-半乳糖苷酶水解底物的差异，其原因可能是产生酶的菌株不同，酶的最适pH、温度也不同，因而降解底物的能力也有差异。不难看出，不同来源的α-半乳糖苷酶水解底物的能力不同，水解底物有选择性。

表3 α-半乳糖苷酶对保育猪生长性能的影响

通常，豆粕中α-半乳糖苷的含量为52.4～74.4 mg/g（Grieshop 等，2003）。 本试验中豆粕的添加量为36.4%，折合α-半乳糖苷的量约22 g/kg日粮。结合水解试验的结果可知，3 U的α-半乳糖苷酶经过4 h的水解，浓度分别是1 mg/kg的蜜二糖、棉子糖和水苏糖D-半乳糖的释放量占总释放量的80%以上。从理论上讲，降解这3种糖最多需要66 U的α-半乳糖苷酶，但是α-半乳糖苷是一类物质，还有痕量的毛蕊花糖（五碳糖）、六碳糖等，这些痕量的糖类的降解也会消耗一定量的酶。该酶的pH耐受性是值得考虑的问题，由于胃是酸性环境，胃内低pH以及胆酸盐的存在，对酶的活性有影响，部分酶活性丧失，因此，本试验酶的添加量为300 U/kg。

Baucells等（2000）试验结果表明，生长猪日粮（含豆粕）中添加α-半乳糖苷酶（0.08 U/kg饲料）提高了料重比，但对增重和养分利用率无影响。Kim等（2003）研究证实，保育猪日粮中添加0.1%CS （混合酶，α-半乳糖苷酶活性 7 U/g、β-1，4-甘露聚糖酶活性22 U/g及微量的其他酶）饲料转化率显著提高9%（P＜0.05）。本试验发现，保育猪日粮中添加加α-半乳糖苷酶显著提高了日增重和饲料转化效率，这可能与添加α-半乳糖苷酶后食糜中的α-1，6-半乳糖苷的含量减少有关。Gdala等（1997）研究报道，保育猪日粮中添加α-半乳糖苷酶，食糜中α-1，6-半乳糖苷的含量均减少，干物质和能量消化率分别提高2.8%和2.3%。本试验结果表明，对于保育猪来说，每千克日粮中添加300 U的α-半乳糖苷酶对于水解22 g的α-半乳糖苷具有积极的正效果，可以显著提高平均日增重和饲料转化效率。

4 结论

α-Gal可有效降解棉子糖，玉米-豆粕基础日粮中添加300 U/kg的α-Gal可显著提高保育猪平均日增重，显著降低料重比。

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